致灰鹤腹泻病原菌的分离鉴定和耐药性分析

陈文东，陈耀年，叶文斌，苏满春，2

(1. 陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃 成县 742500 ； 2. 甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730000)

灰鹤(Grusgrus)别称玄鹤、番薯鹤或千岁鹤，其全身灰色，头顶裸露部分为鲜红色，被有稀疏的黑色短羽，眼后至后枕有一白色条带，喉、前颈和后颈为灰黑色。灰鹤是大型迁徙湿地候鸟，属鹤形目鹤科，体长100～120 cm，是目前世界上15种鹤类中数量最多、分布最广的一种，常栖息于开阔的平原、河滩、湖泊、草地、旷野、沼泽地带，是杂食性动物，常以蛙、昆虫、蜥蜴、鱼类、玉米、谷粒等为食，其中以植物的根、茎、叶、果实和种子为主[1-2]。国内灰鹤主要分布在北纬32°20′～53°，东经76°～135°，垂直分布在海拔65～3 900 m处，包括新疆喀什叶尔羌河流域、甘肃陇南山地和祁连山地、青海柴达木盆地宗加乡、宁夏西北部石嘴山和陶乐县、内蒙古大兴安岭、黑龙江嫩江-乌裕尔河水系流域和吉林白城向海保护区等[3]。

近年来，家养畜禽感染野生动物源细菌性和病毒性传染病频发，陇南作为灰鹤迁徙过程中的重要驻留地，存在灰鹤源病原菌通过粪便或水源传染给生态散养畜禽，引起畜禽传染病暴发流行的可能性，因此野生灰鹤是当地养殖业传染病的重要潜在传染源。陇南师专狗博士动物医院在救治陇南机场防鸟网误伤的野生灰鹤的过程中，发现该灰鹤有腹泻症状，本试验以灰鹤泄殖腔内细菌为研究对象，对泄殖腔内的细菌进行分离鉴定及耐药性分析，以期为该灰鹤的治疗和畜禽养殖防治野生动物源传染病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物 陇南机场防鸟网误伤脚趾的野生灰鹤，成鸟，雌性，体重4.32 kg，体长102 cm，全身大部分羽毛呈灰色，头顶裸露皮肤为鲜红色，眼后至后枕有一白色条带，脚呈黑色。

1.2 主要试剂 BGI 2×Super PCR Mix和BGI D2 000 Plus DNA Ladder，均购自武汉华大基因科技有限公司；细菌基因提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，购自厦门太阳马生物工程有限公司；PCR产物磁珠法纯化试剂盒，购自上海硕美生物科技有限公司；伊红美蓝培养基(EMB)、麦康凯琼脂培养基、肉汤培养基、营养琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和瑞氏染液，均购自青岛海博生物技术有限公司；pMD19-T载体，购自上海雅吉生物科技有限公司；药敏纸片，购自常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品；电泳仪，北京六一仪器厂产品；水浴锅，上海精宏实验设备有限公司产品；测序仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.4 细菌分离鉴定 2020年1月12日，无菌采集灰鹤的泄殖腔粪便，置于装有生理盐水的离心管内充分摇匀，吸取管内溶液至普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝培养基，每种培养基各加入100 μL溶液，涂布均匀，37 ℃恒温培养18 h，用接种环挑取单个菌落至另一培养基上纯化，反复纯化3次，将纯化后的细菌进行瑞氏染色，显微镜观察。

1.5 生化试验 根据参考文献[4]的方法，用纯化好的细菌进行糖发酵试验、吲哚试验、V-P试验、硫化氢试验、甲基红(MR)试验、柠檬酸盐利用试验和尿素酶试验，对细菌做进一步鉴定。

1.6 16S rRNA基因扩增及系统进化树分析 提取分离到的细菌基因组DNA，以此DNA为模板，用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(30 μL)：DNA模板1 μL，2×GC Buffer Ⅰ15 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min；96 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收凝胶目的条带，克隆至pMD19-T载体中，送武汉华大基因科技有限公司测序。测序结果在GenBank中与相关核苷酸序列进行比对，并构建遗传进化树进行分析。

1.7 药敏试验 参照美国临床实验室标准委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推荐的Kirby-Bauer(K-B)法进行药敏试验，测定分离菌株对20种抗菌药(阿米卡星、头孢唑林、多黏菌素、四环素、多西环素、头孢哌酮、林可霉素、万古霉素、头孢氨苄、米诺环素、哌拉西林、头孢曲松、链霉素、卡那霉素、青霉素、红霉素、庆大霉素、头孢呋辛、头孢他啶和氨苄西林)的敏感性，试验结果的判定按美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)(2015年)的标准进行。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 在灰鹤泄殖腔内共分离出3株细菌，分别编号LNHH1、LNHH2和LNHH3，3株细菌在鲜血琼脂培养基上生长，且均无溶血环(图1A～1C)。LNHH1在麦康凯琼脂培养基上生长为红色菌落，菌落呈圆形半透明，表面湿润光滑，边缘整齐(图1D)；在伊红美蓝培养基上呈紫黑色菌落，菌落有金属光泽，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐(图1E)；瑞氏染色后菌体呈长短不一的短杆状，两端钝圆，蓝色，散在分布(图2A)。LNHH2在麦康凯琼脂培养基上不生长；在鲜血琼脂培养基上生长，菌落呈圆形，较小的凸起，表面灰白色，光滑湿润(图1B)；菌体经瑞氏染色后呈蓝色，圆形或椭圆形，单个、成对或短链状排列(图2B)。LNHH3在鲜血培养基上生长，菌落呈较大的圆形凸起，灰白色，表面湿润黏液样，用接种环挑取拉成丝状(图1C)；经瑞氏染色后可见菌体呈较粗的短杆菌，蓝色，单独、成对或聚集存在(图2C)。

图1 细菌分离培养Fig.1 Bacterial isolation and cultureA：LNHH1在鲜血琼脂培养基上的菌落形态； B：LNHH2在鲜血琼脂培养基上的菌落形态； C：LNHH3在鲜血琼脂培养基上的菌落形态；D：LNHH1在麦康凯琼脂培养基上的菌落形态； E：LNHH1在伊红美蓝培养基上的菌落形态A：Colony morphology of LNHH1 on blood medium； B：Colony morphology of LNHH2 on blood medium； C：Colony morphology of LNHH3 on blood medium； D：Colony morphology of LNHH1 on Macconkey medium； E：Colony morphology of LNHH1 on eosin methylene blue medium

图2 细菌瑞氏染色(1 000×)Fig.2 Bacterial Wright staining (1 000×)A：LNHH1； B：LNHH2； C：LNHH3

2.2 生化试验 3株细菌均可以发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖，LNHH1对甘露醇、MR试验和吲哚试验呈阳性反应，硝酸盐、尿素酶、硫化氢、V-P试验、柠檬酸盐反应呈阴性；LNHH2对硝酸盐、MR试验和吲哚试验呈阳性反应，对甘露醇、尿素酶、硫化氢、V-P试验、柠檬酸盐反应呈阴性；LNHH3对甘露醇、硝酸盐、尿素酶、V-P试验和柠檬酸盐反应呈阳性，对MR试验、吲哚试验和硫化氢试验呈阴性反应(表1)。将上述结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》比对，初步判定LNHH1为大肠埃希菌(Escherichiacoli)，LNHH2为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，LNHH3为肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)。

表1 生化试验结果Table 1 Biochemical test results

2.3 16S rRNA基因扩增及系统进化树分析 将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测样品均可得到明亮的大小为1 500 bp的电泳条带(图3)，符合测序条件。测序结果在NCBI上进行BLAST比对。结果显示，LNHH1与大肠埃希菌(MH111527.1)亲源关系最近；LNHH2与粪肠球菌(MH135230.1)亲源关系最近；LNHH3与肺炎克雷伯菌(KY494861.1)亲源关系最近(图4)。结合生化鉴定结果，判定LNHH1为大肠埃希菌，LNHH2为粪肠球菌，LNHH3为肺炎克雷伯菌。

2.4 药敏试验 3株细菌对林可霉素和红霉素均耐药，LNHH1和LNHH2对四环素耐药，LNHH1和LNHH3对万古霉素和青霉素耐药。此外，菌株LNHH1对多西环素耐药，对其他14种抗菌药均敏感；菌株LNHH2对阿米卡星、多黏菌素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素耐药，对头孢唑林、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢曲松和头孢他啶中度敏感，对其他7种抗菌药敏感；菌株LNHH3对氨苄西林中度敏感，对其他15种抗菌药均敏感(表2)。

图3 分离菌株16S rRNA序列PCR扩增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA from the isolated strainsM：DNA分子质量标准； 1：LNHH1； 2：LNHH2； 3：LNHH3M:DNA molecular quality standard; 1:LNHH1; 2:LNHH2; 3:LNHH3

图4 分离菌株16S rRNA序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree base on 16S rRNA nucleotide sequences of the isolated strains▲:本试验所得分离菌株▲:Strains isolated in this study

表2 药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results

3 讨论

保护濒危、珍贵野生动物，对维持生态平衡和生物多样性具有重要意义。灰鹤是国家二级保护野生动物，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ中，有研究报道，目前在我国分布的灰鹤数量仅有21 632～22 401只[3]。张伟木等对草海鹤类主要疫病研究发现，大肠杆菌病为引起野生灰鹤死亡的重要病因之一，其症状包括腹泻、便血以及呼吸困难等[5]。本试验中灰鹤因被陇南机场防鸟网误伤，导致机体免疫力低下，造成体内条件性致病菌大量繁殖而致病。为找出导致灰鹤腹泻的原因，对腹泻灰鹤泄殖腔内细菌进行分离培养、染色镜检、生化试验和16S rRNA基因扩增鉴定，分离得到3株细菌，分别为大肠埃希菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯菌，均为广泛存在于动物肠道内的条件性致病菌[6-8]，在机体免疫力低下时，这些存在于机体肠道内的细菌可成为致病菌，对机体造成严重威胁[9]。已有研究证实，大肠埃希菌正常情况下主要分布在人和动物的呼吸道、消化道和泌尿系统内，在机体免疫力低下时可以引起人和动物发生胃肠道或尿道等多种局部组织器官感染[10-11]。粪肠球菌主要分布在畜禽养殖场所和畜禽产品生产加工的环境中，或存在于人和动物上呼吸道、消化道和生殖道内，另外还广泛分布在自然界中[12-13]，可引起牛、羊、猪、鸡、鸵鸟和蜜蜂等多种动物发病[14-15]。肺炎克雷伯菌具备躲避宿主免疫系统的能力，且菌毛为其提供吸附寄存条件，因此大多数肺炎克雷伯菌具备潜在致病力[16]，鸡、鸭、猪、羊、猫和獭兔等畜禽可感染肺炎克雷伯菌而致病[17]。灰鹤在迁徙过程中会停歇在河流或农田等地，其粪便会污染这些栖息地，从而使当地家养畜禽感染。

3株细菌生化试验的反应特性与从其他家养动物分离鉴定的同种细菌生化特性均有不同[18-20]，表明野生动物源细菌鉴定可将生化试验作为参考，准确鉴定仍需进行16S rRNA基因扩增测序。

目前临床上主要通过抗生素治疗细菌性疾病，随之导致的细菌对抗生素的耐药性问题，已在世界范围内引起高度重视[21]。夏伦斌等对雏鸡源致病性粪肠球菌进行耐药性分析，并利用分析结果进行治疗，结果鸡群病情得到控制[22]。本试验为对腹泻灰鹤精准治疗，避免产生耐药性问题，进行了药敏试验，根据试验结果对腹泻灰鹤进行临床治疗，取得了较好效果。同时，甘肃陇南地处秦巴山区、黄土高原、青藏高原的交汇区域，为长江流域和亚热带气候地区，每年该地区有大量迁徙灰鹤经过，其粪便可能会落入养殖场或通过水源与畜禽间接接触。调查灰鹤源菌株耐药情况，对当地畜禽养殖防治野生动物源传染病也具有重要意义。