高产四甲基吡嗪细菌的筛选鉴定及应用研究

李富强，曹振华，闫培勋，李绍亮，李学思，2，孙金涛，郭淑平

（1.河南省宋河酒业股份有限公司，河南鹿邑 477265；2.河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南郑州 450000）

独特的酿酒工艺造就中国白酒成分的多样性，目前科学技术已检测出的优质白酒成分达1700 多种。经研究白酒主要成分除水和乙醇外，还含有相当一部分不饱和脂肪酸、芳香族化合物和萜烯类化合物，该类物质对抗癌、治癌、预防疾病有明显的作用。中国白酒中的四甲基吡嗪（TTMP）（中药川芎嗪）由微生物（酶）与热动力学反应（美拉德反应）联合作用生成，在制曲和堆积发酵中产生，经蒸馏带入酒中，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚的作用，赋予中国白酒健康功能[1-4]。

中国白酒的酿造工艺是最为传统的固态发酵，四甲基吡嗪在各个香型中含量有所不同[5]。中国白酒的传统固态发酵法在酿造工艺、原料选择以及糖化发酵剂种类、自然环境等诸多因素上有很大差异，因此在各个香型中TTMP 的含量也有着很大的差异[6]。测定发现酱香型白酒中四甲基吡嗪含量最为突出，为所有香型之最[7]，其次为芝麻香型。四甲基吡嗪在酱香型白酒中的含量与其独特的酿造技术密切相关。高温制曲、高温堆积为四甲基吡嗪的生成创造了有利条件[8]。

本实验以宋河中高温大曲为研究对象，筛选中高温大曲中高产四甲基吡嗪的微生物，将其应用到酿酒生产过程中，以期提高原酒中健康因子含量，为提高原酒质量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

实验原辅料：中高温大曲，来自宋河酒业制曲车间；麸皮，市售优质麸皮。

试剂及耗材：氢氧化钠，乳酸，盐酸，酚酞，己酸，无水乙醇，葡萄糖，硫酸铜，10 g/L 次甲基蓝溶液，pH4.6缓冲溶液，2.5 mol/L硫酸溶液，凡士林，牛肉膏，蛋白胨，琼脂粉，麦芽浸粉，酵母膏等。

仪器设备：可见分光光度计（721型），上海悦丰仪器仪表有限公司；气相色谱分析仪（GC102AT 气相色谱仪），安捷伦科技（中国）有限公司；电子天平（MD200-3 型），上海民桥精密科学仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（101 型），北京市永光明医疗仪器有限公司；真空抽滤装置；电热恒温水浴锅（HH-6型），金坛市金南仪器制造有限公司；循环水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型），天津华鑫仪器厂；电子万用炉（DL-100 型），天津市泰斯特仪器有限公司；摇床；试管；烧杯；玻璃棒等。

1.2 实验方法

1.2.1 产四甲基吡嗪菌株的筛选

富集培养：称取1 g 曲粉于50 mL 无菌水中（带有5 粒玻璃珠），200 r/min 振荡30 min，使之充分混匀，于85 ℃水浴锅中处理30 min，静置，吸取1 mL上清液加至装有50 mL 富集培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min培养过夜。

分离纯化：将过夜培养的菌液适当稀释涂布，于37 ℃培养箱中倒置培养48 h。挑取表面不光滑、边缘不整齐的特征菌落，划线分离，将得到的单菌落保藏于营养琼脂斜面，菌落长出后，4 ℃冰箱保藏备用。

菌株初筛：Zhu等[9-11]提出发酵体系中四甲基吡嗪的前体物质即乙偶姻，可借助VP 试验检测乙偶姻的产量筛选四甲基吡嗪高产菌株。将菌种接种至装有10 mL VP 培养基的试管中，每株三管，37 ℃、150 r/min 培养96 h，发酵结束后检测乙偶姻的产量，挑选呈阳性反应且吸光度值高的菌株作为进一步复筛菌株。

1.2.2 高产四甲基吡嗪的鉴定

将初筛得到的菌株接种于装有100 mL 发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min的条件下培养120 h，发酵结束后通过GC-MS 对发酵液进行定性分析，测得菌株产四甲基吡嗪的相对含量，用气相色谱法对高产四甲基吡嗪菌株进行定量分析。

1.2.3 分子生物学鉴定方法

根据细菌DNA 提取试剂盒说明书，采用细菌16S rDNA 通 用PCR 引 物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGT-TACCTTGT-TACGACTT-3')进行扩增，在25.0 μL PCR 反应体系中，加上、下游引物1492r 和27f 各1.0 μL，Mix 12.5 μL，细菌DNA 2.0 μL，双蒸水（ddH2O）8.5 μL。PCR 扩增条件为初始变性94 ℃、5 min，变性94 ℃、0.5 min，退火55 ℃、0.5 min，复性72 ℃、1.5 min，30个循环，最后延伸72 ℃、10 min。取2 μL DNA 溶液于1 %琼脂糖凝胶100 V 电泳40 min左右。

PCR 扩增后的产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列分析。将测序结果录入美国国家生物信息技术中心（NCBI）数据库中进行BLAST 比对，利用MEGA5.0 软件进行系统发育树的建立。

1.2.4 应用方法

利用种子培养基培养BQ-1 菌株（高产四甲基吡嗪），培养后的菌株以2 %接种量（相对于投粮量）均匀接种到堆积发酵前的酒醅中，堆积过程中菌株繁殖代谢产生四甲基吡嗪，提高芝麻香白酒中吡嗪类物质及乙偶姻等主体风味物质的含量。发酵结束后检测原酒中风味物质及四甲基吡嗪的含量。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛

用平板稀释涂布法从宋河中高温大曲中分离出9 株菌落形态差别较大的细菌，分离纯化后筛选出的9 株形态差异结果如表1 所示。将分离纯化出的9 株菌株分别点接于脱脂牛奶培养基中，观察菌落周围产生透明圈的情况，如图1 所示。TTMP 的前体物质为乙偶姻和铵，铵的产生和蛋白酶活性的强弱相关并且蛋白酶也是曲粉的主要质量指标。本实验结果通过测量计算培养基上菌落透明圈直径与菌落直径比值的大小，来确定菌株产蛋白酶能力，即透明圈直径与菌落直径的比值越大，产蛋白酶的能力越高。结果如表2所示。

表2 9株菌的R值

图1 9株菌株在脱脂牛奶培养基上产生透明圈情况

表1 9株细菌的形态特征

根据表2 所示，菌株BQ-12、BQ-1、BQ-37、BQ-38、BQ-42 5 株菌的透明圈直径D 与菌落直径d 的比值R 相对于其他几株菌的比值较大，其中菌株BQ-1 的比值最大，说明菌株BQ-12、BQ-1、BQ-37、BQ-38、BQ-42 这5 株菌产蛋白酶能力相对于其他几株较强。因此将菌株BQ-12、BQ-1、BQ-37、BQ-38、BQ-42作为产四甲基吡嗪的初筛菌株。

2.2 高产四甲基吡嗪的鉴定

将初筛菌株进行发酵摇瓶实验，通过GC-MS分析测定发酵液的成分，分析得出菌株BQ-1 产四甲基吡嗪，其他几株不产。菌株BQ-1 发酵液成分如表3 所示。由表3 可知，菌株BQ-1 产基吡嗪物质10 种、酮类物质3 种、酯类6 种、醇类5 种。该菌株除产四甲基吡嗪（Pyrazine,tetramethyl-），也产乙偶姻、二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、己酸己酯等化合物。

表3 菌株BQ-1发酵液成分GC-MS分析结果

运用气相色谱技术对菌株BQ-1 发酵液中四甲基吡嗪含量进行定量分析。通过分析得出，在发酵液中菌株BQ-1四甲基吡嗪的产量达到25 mg/L。

2.3 菌株的分子生物学鉴定

采用通用引物27F 和1492R 利用PCR 扩增获得高产菌株BQ-1 的16S rDNA 序列，将PCR 扩增后的产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序，测序结果如下。

用DNAMAN 校正后的序列在NCBI 服务器上用BLAST 进行同源检测，将与菌株16S rDNA D1/D2 区域序列相似的模式菌种序列、种名以及分类号下载保存；采用MEGA 5.1 Unweighted Pair Group Method Using(NJ)构建系统发育树测序结果拼接之后提交到NCBI 基因数据进行Blast 同源性分析，分子生物学鉴定结果与系统发育树结果如图2。

图2 BQ-1系统发育树

经形态学和分子生物学鉴定该菌株为Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）。

2.4 实验原酒感官尝评结果

对所产基酒进行感官尝评，由五位国家级品酒师和十位省级品酒师根据相关文献[12-13]并结合实际情况进行共同品评打分。品评结果见表4。

表4 混合酒样感官尝评结果

由表4 可知，实验窖池所产原酒无色、清亮透明，相比于对照样芝麻香突出、焦香重、香味协调、口感丰富、风格突出典型。

3 讨论

本实验以宋河中高温大曲为实验材料，从宋河中高温大曲中筛选出1 株高产四甲基吡嗪的细菌，该菌株在实验室条件下四甲基吡嗪产量达到25 mg/L，该菌株除产Pyrazine,tetramethyl-（四甲基吡嗪）之外，还产Pyrazine,methyl-（2-甲基吡嗪）、Pyrazine,2,5-dimethyl-（2,5-二甲基吡嗪）、Pyrazine,2,6-dimethyl-（2,6-二甲基吡嗪）、Pyrazine,ethyl-（2-乙基吡嗪）、Pyrazine,2,3-dimethyl-（2,3-二甲基吡嗪）、Pyrazine,2-ethyl-6-methyl-（2-乙基-6-甲基吡嗪）、Pyrazine,trimethyl-（三甲基吡嗪）、Pyrazine,ethenyl-（2-乙烯基吡嗪）、Pyrazine,2-ethenyl-6-methyl-（2-乙烯基-6-甲基吡嗪）、2,3-Butanedione（2,3-丁二酮）、Acetoin（乙偶姻）等物质。

采用通用引物27F 和1492R，利用PCR 扩增获得高产菌株BQ-1 的16S rDNA 序列，经形态学和分子生物学鉴定该菌株为Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）。通过扩大培养把该菌株应用到芝麻香白酒堆积过程，结果能明显提升芝麻香白酒焦香及芝麻香型白酒质量。

本实验丰富了大曲微生物的功能，为强化大曲的生产及提升白酒中健康因子的含量提供了理论基础。但文章对菌株的应用范围较小，在后期的研究中应加大此类研究。