利用花药培养和分子标记辅助相结合方法选育香软型粳稻新品种

黄卫峰,闫 影,王 凯,张丽霞,胡泽军,吴书俊*

(1上海市崇明区农业技术推广中心,上海 202150;2上海市农业科学院作物育种栽培研究所∕上海农产品保鲜加工工程技术研究中心,上海 201403)

水稻是我国主要的粮食作物之一,我国有60%以上人口以稻米为主食。过去20年来,随着经济社会的快速发展,人民生活水平逐渐提高,虽然我国人均稻米消费量不断下降,但粳米的人均消费量却增加了40%,同时消费者对稻米食味品质的要求也越来越高,市场对高品质优质粳米的消费需求日益突出[1]。为满足稻米产业和消费市场的需求,选育优良食味粳稻新品种已成为当前粳稻育种工作的重点。

长三角地区居民历来喜欢食用香味浓郁、口感柔软的粳米。香味是稻米的重要品质特征之一,研究表明,水稻香味受到BADH2基因控制,该基因编码一个甜菜碱醛脱氢酶,能够分解香稻香气主要成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)的前体物质。在不同的香稻品种中,BADH2基因结构发生变异,编码酶的功能缺失,导致2AP前体物质增加,从而累积2AP,使稻米产生香味[2]。目前,在基因BADH2中至少存在17个变异位点,其中第7外显子8 bp缺失及3 bp突变和第2外显子7 bp缺失是香稻资源中中较为常见的2个变异位点[3]。利用这些变异位点的功能标记进行分子育种已成为香稻育种工作中的重要技术手段,吴书俊等[4]借助分子标记辅助选择定向聚合抗条纹叶枯病基因Stv-bi和香味基因badh2-E2,选育出优质、抗条纹叶枯病的高产香粳品种‘沪香粳106’。稻米的食味品质性状属于复杂的综合数量性状,其中直链淀粉含量是影响稻米食味的主要因素之一。直链淀粉含量受Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶GBSSⅠ(Granule bound starch synthesisⅠ)调控,Wx基因存在多个复等位变异,包括Wxa、Wxb、Wxop∕hp、Wxlv、Wxmw、Wxmp、Wxin和wx等,这些变异导致稻米胚乳中直链淀粉含量的差异[5]。其中Wxmp在编码区第497位有一个G∕A的SNP,影响Wx蛋白活性,进而造成直链淀粉含量降低,该基因在软型粳米品种选育中应用广泛,国内育种家利用该基因育成多个低直链淀粉含量的优质稻品种,如‘南粳46’‘沪软1212’等。

稻瘟病是由子囊真菌(Magnaportheoryzae)引起的一种危害严重的水稻真菌病害,是水稻世界性三大病害之一。近年来我国稻瘟病年均发生面积约为4.7×1010m2,2013年以后发病情况更呈现上升趋势。实践证明,选育推广具持久和广谱抗性的水稻新品种是防治稻瘟病最有效的方法,当前全国各地在新品种审定时都已实施对稻瘟病表现感病的“一票否决制”[6-7]。截至目前,已鉴定抗稻瘟病质量性状基因100多个,数量性状位点500多个。研究表明,抗病基因Pita、Pi5、Pi2、Pikm和Pigm在长三角地区对稻瘟病表现出广谱高效抗性,在抗稻瘟病粳稻育种中具有重要应用价值[8-9]。

花药培养是一种双单倍体(DH)育种方法,利用该技术可以快速获得纯合二倍体,具有选择效率高、育种周期短等优点。近年来花药培养技术在水稻育种中得到广泛应用,余波等[10]利用花药培养技术实现中美水稻亲本之间有利性状的互补,获得改良型中国水稻新种质18份、改良型美国水稻新种质6份。本研究以优质粳稻新品系沪香软16-18为母本,抗稻瘟病粳稻新品系沪香粳16-44为父本进行杂交配组,利用花药培养技术、分子标记辅助技术和常规育种技术相结合的育种策略,快速实现多个目标基因聚合,育成抗稻瘟病香型优质食味米新品种‘崇尚2022’,为高效选育香软型优质粳稻新品种提供成功的育种实践。

1 材料与方法

1.1 供试材料与选育经过

沪香软16-18是上海市农业科学院作物所水稻中心以太湖香粳∕南粳46杂交选育而成的优质粳稻新品系,具有香味、低直链淀粉含量、食味品质优良的特点;沪香粳16-44是该团队以南粳46∕武香粳19杂交选育而成的优质粳稻新品系,具有香味,并且稻瘟病抗性综合指数在5级以下。

2016年冬,在上海南繁育种基地开始以香软型粳稻新品系沪香软16-18为母本,以香型抗稻瘟病粳稻新品系沪香粳16-44为父本进行杂交配组,并收获F1杂交种子;2017年夏,在上海市农业科学院庄行综合试验站种植F1代植株,当F1代植株处于孕穗打苞阶段时,剥取幼穗进行花药离体培养后得到花培幼苗;2017年冬,种植花培第一代植株并收获种子,于2018年夏季种植形成82个遗传稳定的DH姊妹株系;经过2019—2020年连续两年综合性状的鉴定,于2020年在10个DH姊妹系中选择最优1个香软型纯合株系,并命名为‘崇尚2022’(图1)。

图1 ‘崇尚2022’的选育过程Fig.1 Breeding process of‘Chongshang2022’

1.2 目标基因检测

在水稻移栽成活后采集幼嫩叶片,采用CTAB法提取水稻全基因组DNA[11]。利用Bradbury等[12]根据Badh2基因编码区第7外显子8 bp缺失和3 bp变异设计的功能标记区分香稻和非香稻品种;利用陈涛等[13]根据基因Wxmp由Wx位点第497位核苷酸G∕A的等位变异设计的引物扩增后测序区分Wx是否Wxmp变异;利用王忠华[14]根据Pita基因抗感序列差异设计的功能标记检测抗稻瘟病基因Pita(表1)。

表1 目标基因及其共分离分子标记信息Table 1 Target genes and theirco-segregatedof molecular markers

PCR扩增体系20μL,包含DNA模版2μL,2×Hieff PCR Master Mix(With Dye)10μL,引物等体积混合液1.6μL,ddH2O 6.4μL。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,所用试剂购自上海翊圣生物科技有限公司。反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55—57℃退火30 s,72℃复性30 s,共33个循环;72℃延伸10 min,10℃保存。除引物Wx-mp-O-F和Wx-mp-O-R扩增产物需要测序以外,其余产物经含有核酸染料的2%琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外凝胶成像系统内观察多态性差异。

1.3 水稻香味鉴定

分别采用氢氧化钾(KOH)法和咀嚼法鉴定水稻叶片香味和米粒香味[15]。

1.4 稻米直链淀粉含量测定

按照国家标准GB∕T 15683—2008《大米直链淀粉含量的测定》方法测定直链淀粉含量,每个样品重复测定2次,取平均值。

1.5 稻瘟病抗性鉴定

用于稻瘟病抗性鉴定的供试菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所提供,每一年的孢子混合液为上一年度江苏省及周边地区稻瘟病优势生理小种混合菌液。在水稻孕穗初期,向幼穗穗苞内注射接种稻瘟病菌菌株孢子混合液,每株选1个穗苞注射1 mL,每个株系注射10株。在水稻成熟期,按国家标准GB∕T 15790—2009《稻瘟病测报调查规范》调查水稻穗颈瘟的发病情况,分级记载。

1.6 花药培养方法

在孕穗期,选择长势健壮、无病斑的植株,取处于单核靠边期、叶枕距为5—7 cm的水稻幼穗,保留剑叶,用75%酒精表面消毒,并用湿纱布包裹,然后用保鲜膜包裹,置于8℃低温预处理12 d。在无菌台上选取合适的幼穗剥开,用1%的次氯酸钠溶液消毒30 min,灭菌水洗8次,取出花药,接种于YD2培养基,26—27℃,暗培养(约30—40 d)。待愈伤组织长至2 mm时,转移至分化培养基FH4,暗培养2 d,后光照培养,温度26—27℃。

YD2培养基:N6培养基+植物凝胶3.5 g∕L+蔗糖50 g∕L+2,4-D 2.0 mg∕L+NAA 1.0 mg∕L+KT 1.0 mg∕L+水解酪蛋白0.5 g∕L,调pH为5.8。

FH4培养基:MS培养基+植物凝胶3.5 g∕L或琼脂6 g∕L+蔗糖30 g∕L+NAA 0.5 mg∕L+6-BA 2.0 mg∕L+MET 2.5 mg∕L+水解酪蛋白0.5 g∕L,调pH为5.8。

2 结果与分析

2.1 亲本基因型鉴定

分别利用香味等位基因badh2-E7、低直链淀粉含量基因Wxmp以及抗稻瘟病基因Pita的功能标记对亲本沪香软16-18和沪香粳16-44进行检测。结果表明,沪香软16-18携带基因badh2-E7和Wxmp,而不携带Pita;沪香粳16-44携带Pita,而不携带badh2-E7和Wxmp(图2)。沪香粳16-44的香味是由Badh2基因第2外显子变异所导致。

图2 亲本中香味等位基因badh2-E7(A)、低直链淀粉含量基因Wxmp(B)和抗稻瘟病基因Pita(C)的分子标记检测结果Fig.2 Genotypedection of badh2-E7(A),Wxmp(B)and Pita(C)in parent materials

2.2 F1花药培养株系的获得

2017年春季,在上海市农业科学院南繁基地将沪香软16-18和沪香粳16-44杂交,夏季在上海种植F1,取幼穗开展花药培养,共接种2 050枚花药,获得胚状体262个,诱导率12.8%,成苗168株,成苗率64.1%,诱导、分化及幼苗表现良好(图3)。2017年冬季,在海南种植168个花培H0代植株,2018年夏季,在上海市农业科学院庄行综合试验站种植筛选出的82个花培H1代株系。

图3 花药培养Fig.3 Anther culture

2.3 花药培养株系的基因检测

分别利用基因badh2-E7、Wxmp和Pita的功能标记对82个株系进行检测,其中23个株系携带香味等位基因badh2-E7,35个株系携带低直链淀粉含量基因Wxmp,53个株系携带抗稻瘟病基因Pita(表2)。其中有10个株系含有全部3个基因。

表2 82个株系基因检测结果Table 2 The results of molecular detection in 82 lines

2.4 花药培养株系的香味、直链淀粉含量及稻瘟病抗性综合鉴定

利用氢氧化钾(KOH)法鉴定同时携带基因badh2-E7、Wxmp和Pita的10个DH株系叶片香味,同时开展直链淀粉含量测定和田间稻瘟病抗性鉴定,结合田间农艺性状、抗性接种鉴定结果和食味口感水平选出最优株系DH48,命名‘崇尚2022’。

2.5 ‘崇尚2022’农艺性状和产量水平

‘崇尚2022’在上海地区作移栽稻全生育期145 d左右,一般在10月上中旬成熟;株高90 cm左右,每667 m2有效穗数21万—23万,每穗总粒数120—130粒,结实率92%—95%,千粒重26—27 g。2020年开始参加上海市区试,667 m2平均产量620.2 kg,2021年区试667 m2平均产量677.9 kg,2021年生产试验667 m2平均产量644.3 kg。‘崇尚2022’整个生育期长势旺盛,株型紧凑,叶片挺直,分蘖力中等,田间调查表现株高矮、抗倒性强;田间表现对稻瘟病抗性较好,含抗稻瘟病广谱高效基因Pita(图4C)。2021年经江苏省农业科学院植物保护研究所进行抗病性鉴定,稻瘟病综合抗病指数为4.7(中感)。

表3 香味、直链淀粉含量和稻瘟病抗性评价结果Table 3 Evaluation of fragrance,amylose content and blast resisitence

2.6 ‘崇尚2022’稻米品质

‘崇尚2022’具有明显香味,含有香味基因badh2-E7,其来源于香型亲本沪香软16-18(图4A)。‘崇尚2022’口感柔软有弹性,含有低直链淀粉含量基因Wxmp,其来源于亲本沪香软16-18(图4B)。经检测,‘崇尚2022’直链淀粉含量一般在9.5%—12.7%,当水分含量保持在15.0%以上时大米外观透明度较好。2020—2021年的品质检测结果表明(表4),除遗传因素导致的低直链淀粉含量以外,其余品质指标都在优质米三等以上,其中整精米率、垩白度、胶稠度等主要加工、外观和食味指标两年均在二等以上。2019—2020年在上海市农业科学院作物所稻米品质分析实验室对其品质指标进行检测,直链淀粉含量分别为11.0%、11.2%,胶稠度分别为86.5 mm、86.0 mm,蛋白质含量分别为8.5%、9.5%,米饭食味值分别为81分和84分。

图4 ‘崇尚2022’香味等位基因badh2-E7(A)、低直链淀粉含量基因Wxmp(B)和抗稻瘟病基因Pita(C)的分子标记检测结果Fig.4 Genotypedection of badh2-E7(A),Wxmp(B)and Pita(C)in‘Chongshang2022’

表4 2020—2021年度‘崇尚2022’稻米品质检测结果Table 4 The test for rice quality of‘Chongshang2022’in 2020 and 2021

3 结论与讨论

优良单株选择是水稻育种的重要环节,传统的育种方式存在表型鉴定难、育种周期长、工作量大、效率低等问题,而且还容易受到环境影响,鉴定结果表现不稳定。利用花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术进行水稻育种,可快速获得目标性状稳定遗传的株系,有效缩短育种年限,减少表型鉴定的工作量和难度。同时,通过花药培养建立起来的DH群体可以快速形成长久稳定遗传的种质资源,适宜在育种中广泛应用。当前,利用花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术开展水稻育种的研究多有报道。徐华山等[16]利用花药培养技术结合香味基因fgr的检测,快速创制长粒型优质籼稻材料‘润香玉’;査中萍等[17]利用花药培养结合广亲和基因S5n的分子标记辅助选择,快速选育广亲和材料。

当前上海主栽优良食味米品种多为熟期偏迟、株高偏高的软型粳稻品种,对稻瘟病抗性、倒伏抗性普遍偏弱。提高软型优质粳稻品种的稻瘟病抗性和倒伏抗性已经成为当前上海优质稻米产业绿色健康发展亟需解决的瓶颈问题。本研究利用花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术高效选育出携带香味基因badh2-E7、低直链淀粉含量基因Wxmp和抗稻瘟病基因Pita,同时株高在90 cm左右的香软型优质粳稻新品种‘崇尚2022’,并于2022年10月通过上海市农作物品种审定(审定编号:沪审稻2022007)。该品种表现田间抗倒性强,稻瘟病抗性好,生态适应性广,稻米香味浓,米饭食味口感好。相较于上海当前主栽的优良食味米品种,‘崇尚2022’稻瘟病抗性和抗倒伏性均有了显著提高,同时生育期变短,对于适时收获并对绿肥等冬季作物适时播种具有积极作用。