12种中草药活性成分治疗肺结核潜在机制研究

任明辉，央 拉，杨 娟，任建伟，杜宝中

（西藏大学医学院,西藏拉萨 850000）

肺结核是由结核分枝杆菌感染的一种慢性传染病。2020 年WHO 发布全球新发结核病患者约987万[1]，在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第2 位，2020 年我国新发结核病患者约84.2万，发病率为59/10 万，其中6.5 万为多重耐药性肺结核。现有的抗结核药物数量和高效性有限，新药物的研发面临许多障碍，而耐药性肺结核、多重耐药性肺结核病的出现，使得肺结核的临床治疗面临着药物缺乏的现状，因此寻找高效、低毒且具有抗耐药性治疗药物迫在眉睫。

越来越多的研究阐明，中草药具有良好的抗菌作用、不良反应相对较小且不易出现耐药性等特点[2-5]。近年来中草药体外抗结核分枝杆菌有了很大进展，但中草药活性成分治疗肺结核病研究较少。本研究从体外抗结核分枝杆菌效果较好的中草药活性成分探究其治疗肺结核病的潜在机制，为临床上中草药活性成分治疗肺结核病提供相应的理论基础。

1 方法

1.1 体外抗结核分枝杆菌活性效果较好的中草药活性成分获取

利用PubMed、中国知网等数据库，输入“中草药”和“结核分枝杆菌”，以体外抗结核分枝杆菌MIC值≤200 mg/L为筛选标准进行检索，后通过Zinc数据库下载，通过StoneMIND Collector 软件进行结构识别并对中草药活性成分进行修饰和下载其sdf格式。

1.2 肺结核病的核心靶点基因及相应蛋白结构获取

利用GeneGards 数据库，以“Pulmonary Tuberculosis”为检索名称，限定“score≥30”筛选出肺结核病的核心靶点基因。蛋白分子下载通过PDB 数据库，根据分子对接蛋白结构六大原则[6]进行筛选，最终获取可靠性最高的蛋白结构并下载PDB Format格式。

1.3 分子对接预测活性成分与肺结核病的核心靶点基因结合活性

利用Discovery Studio Client 2019 软件将检索出的中草药活性成分和肺结核病的核心靶点基因进行分子对接预测其结合活性。

1.4 生物通络富集分析

利用DAVID 数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)，设置“Homo sapiens”分析条件后，对肺结核病的核心靶点基因进行KEGG富集分析，设定标准为P＜0.01，并对结果作桑基图、条形图进行可视化分析。

2 结果

2.1 体外抗结核分枝杆菌活性较好的中草药活性成分获取结果

经过检索和筛选共获取12 种在体外抗结核分枝杆菌具有较好活性的中草药活性成分，分别是姜黄素、白黎醇素、虫草素、槲皮素、大蒜素、异甘草素、穿心莲内酯、没食子酸、黄连素、黄芩苷、红景天苷、岩白菜素。

2.2 肺结核病的核心靶点基因及相应蛋白结构获取结果

利用GeneGards 数据库，以“Pulmonary Tuberculosis”为检索名称，共检索出1985 个靶点基因，根据“score≥30”筛选出20 个核心靶点基因。蛋白结构下载通过PDB 数据库，根据分子对接蛋白结构六大原则，共计获取14个核心靶点基因相应的蛋白结构，其相应核心靶点基因为CAV1、CRP、HLA-DRB1、IFNG、IL6、IL10、MMP1、SERP、SFTPC、SFTBD、TGFB1、TLR2、TNF、TERT。

2.3 分子对接预测结合活性结果

利用ZinC 数据库进行检索12 种中草药活性分子3D 分子结构式，并通过StoneMIND Collector 软件进行结构识别和修饰，利用Discovery Studio Client 2019 对中草药活性成分和蛋白进行修饰后完成对接。根据分子对接结果评分，对接效果越好即评分越高图示颜色越红，无法对接即对接失败对接评分为0分并用深蓝色表示，如图1。

图1 12种中草药活性分子与肺结核病的核心靶点基因对接热聚图

2.4 生物通络富集分析结果

将肺结核病的核心靶点基因数据导入DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路分析，设定标准为P＜0.01，共计获得136条GO功能条目和49条KEGG 通路，对与治疗肺结核病相关性较高的KEGG 信号通路和GO功能进行可视化分析，见图2、图3。

图2 KEGG通路分析桑基图

图3 GO功能分析条形图

3 讨论

肺结核是一种严重危害人类健康的疾病。由于耐药性和多重耐药性肺结核的增加，现有的抗结核药物数量和高效性有限，新药物的研发面临许多障碍，迫切需要找到新的解决方案。

从筛选出的肺结核病核心靶点基因上看，CAV1可激活和调节先天免疫、炎症、血管通透性和白细胞迁移，与toll 样受体4(TLR4)结合，然后介导NF-κB激活并触发炎症反应[7-8]。CRP 是一种宿主防疫蛋白，CRP 复合物对补体激活和调节是有益的[9]。IFNG和IFNGR1的单核苷酸多态性可能参与不同人群肺结核的发病机制，IFNG/IFNGR1 途径在人类对结核分枝杆菌感染的免疫反应中具有一定潜在作用[9]。IL-6已被鉴定为一种26 kD 的分泌蛋白，可作为疾病治疗的靶点[10]，Gp130 是IL-6 细胞因子家族共有的受体成分，在脾、肺、心脏和肝脏等多个器官中普遍表达，IL-6 家族细胞因子可通过Gp130 同源二聚体或含Gp130 的异源二聚体转导其信号达到治疗肺部炎症的目的[11]。IL-10是一种具有抗炎特性的细胞因子，是维持有效免疫和组织保护之间微妙平衡的核心[12]。通过限制对病原体免疫反应从而防止对宿主的损害在感染中起核心作用[13]。MMP1 是呼吸道表面基质金属蛋白酶对肺损伤后完整上皮的恢复以及肺稳态的恢复至关重要[14]。在机体缺氧时HIF-1α 积累导致促炎因子表达，但MMP1 在缺氧状态下表达量超正常情况下170倍并具有活性，对肺组织保护性增强[15]。SERP 可有效减轻炎症、减少纤维化和新生血管形成，而不影响其他器官[16]。SERP 可能是绕过高尔基体的主要分泌机制，并且在神经突生长中特别活跃和重要[17]。SFTPC、SFTPD 为肺表面活性物质，是生物物理功能所必需的，其破坏会影响正常肺的健康。SFTPC 基因变异可能会影响宿主对结核分枝杆菌的防御反应，并导致活动性结核病患者出现多种临床表现[18]。TGFB1、TLR2 信号通路和单核细胞功能和吞噬作用相关[19]。TGFB1 可增强局部的分枝杆菌抗菌能力[20]。TERT 为端粒酶逆转录酶。是目前疾病治疗的新靶点之一。TERT 除了对癌症的治疗有作用还可通过PI3K-AKT、DNMT3B 及WNT/β-catenin 信号通路参与机体部分生理作用[21]。TNF信号通路介导的炎症反应在抗结核分枝杆菌进程中起重要作用，可促进趋化因子、INF-γ、TNF-α、IL-1 等的分泌，对于调节感染结核分枝杆菌后的细胞凋亡或坏死产生一定影响[22]。

从图1中不难发现姜黄素、黄芩苷、虫草素、穿心莲内酯、白黎醇素、木犀草素较其他中草药活性成分在治疗肺结核方面效果更好。姜黄素是一种二酮类化合物，主要存在于姜黄、莪术、娑罗子、山茱萸、当归、大枣等中草药中，是一种有效的细胞凋亡诱导剂，它是巨噬细胞用来杀死细胞内结核分枝杆菌的一种效应机制、也可保护人类巨噬细胞免受结核分枝杆菌感染，并与结核病预后相关[23-24]。黄芩苷是一种黄酮类化合物,主要存在于黄芩、半夏、半枝莲、柴胡、木蝴蝶、雷公藤、马尾莲等中草药中。黄芩苷是一种极好的的抗分枝杆菌药物，同时又作为一种抗炎剂在临床上广泛使用，通过抑制PERK/TXNIP/NLRP3 轴减少细胞凋亡和抗分枝杆菌及抗炎作用[25-26]。虫草素是一种核苷类化合物，存在于冬虫夏草、茄根、藕节、大叶青、桃仁等中草药中。虫草素通过劫持细菌腺苷激酶杀死结核分枝杆菌[27]。穿心莲内酯为二萜内酯类化合物，主要存在于蝉蜕、穿心莲、沉香等中药中，通过调节Notch1/Akt/NF-κB 轴在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中发挥抗炎作用[28]。白黎醇素，一种非黄酮类多酚有机化合物，存在于虎杖、枸骨叶、花生衣、大黄、木通等之中，可增强机体免疫力，在抗结核分枝杆菌和治疗结核病中具有一定疗效[29-30]。白藜芦醇通过干扰免疫细胞调节、促炎细胞因子的合成和基因表达来调节免疫[31]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，主要存在于艾叶、八角茴香、萹蓄、北刘寄奴、败酱草、灯心草等中草药中。木犀草素可通过促进中枢记忆T 细胞反应来增强长期抗结核免疫，还可增强自然杀伤T 细胞的活性，并提供一种避免耐药性发展、改善疾病癒后的方法[32-33]。

近年来发现，通过增强机体对结核分枝杆菌的免疫防御、干扰结核分枝杆菌利用的机体机制、防止其在机体组织中持续或复制及靶向移动可能导致疾病或免疫病理的途径对结核分枝杆菌有抗菌或抑菌治疗效果[34]。本次通过生物信息学的方法预测出12种中草药活性成分主要通过肺结核通路、IL-17 信号通路、吞噬体通路、TGF-β 信号通路等和体液免疫反应、IL6 产生的正调节、对革兰氏阳性菌的防御反应、对NF-κB 转录因子活性的正向调节、JAK-STAT 级联的正调节、对细菌源性分子的反应等功能发挥增强机体免疫力、提高对结核分枝杆菌杀伤力、增强巨噬细胞和其他免疫细胞的吞噬、呈递抗原的能力、减少肺上皮细胞中趋化因子的表达等作用达到治疗肺结核的目的。

通过分子对接结果可发现，在中草药活性成分治疗肺结核方面可联合多种成分治疗达到靶点覆盖率及结合率最优化以达到最佳的治疗效果。本研究也存在一定不足之处，虽然通过生物信息学方法探索12 种了活性成分治疗肺结核潜在作用机制，但基于不同数据库收录靶点基因、疾病基因以及算法等有诸多不同，因此本研究结果仍需要后期进一步实验验证。