固相萃取-高效液相色谱法同时检测饮用水中MC-LR、灭草松和2,4-D

亢卫华，杨 迪，王 昕，李建风，王元琦，王海雁*，刘永文*

(1.大同市供水排水集团有限责任公司，山西大同 037009；2.山西大同大学化学化工学院，山西大同 037009)

微囊藻毒素-LR(MC-LR)是微囊藻毒素中毒性分布最强的一类物质，它是水体被氮、磷等植物营养元素污染造成水体富氧化而产生的，化学名称为D-丙氨酸-L-亮氨酸-赤-p-甲基-D-异天冬氨酸-L-精氨酸-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸，分子式为C49H74N10O12，化学性质稳定[1]，对人体的肝脏、神经系统和肾脏等都具有明显的毒性，被世界卫生组织国际癌症研究机构定为2B 类致癌物[2-3]。灭草松，又称苯达松，是一种具有低毒性的苯噻二嗪类化合物，分子式为C10H12N2O3S，化学名称为3-异丙基(1H)-苯丙-2,1,3-噻二嗪-4-酮-2,2-二氧化物，灭草松在酸性和碱性条件下稳定，光照条件下不稳定，对人体有致癌、致畸的危害。2,4-D 是一种苯氧基极性化合物，化学名称为2,4-二氯苯氧乙酸，分子式为C8H6C12O3，低毒性但抗生物降解能力强，对植物有较高的选择性，对大部分阔叶类杂草防治效果理想，2,4-D 易溶于水和其他溶剂，可快速渗透植物的叶和根，目前仍是一种广泛使用的除草剂[4]。灭草松、2,4-D 均为农药类化合物，在农业生产上广泛应用，其用量大、用途广，对人体有毒性[5]。以上三种化合物的分子结构如图1 所示。

图1 微囊藻毒素-LR、灭草松、2,4-二氯苯氧乙酸分子结构式

在《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006) 中规定MC-LR、灭草松、2,4-D 的含量指标分别为0.001、0.3、0.03 mg/L，与世界卫生组织规定相同[6-7]。

三种物质常用的检测方法有高效液相色谱法[8]、毛细管电泳法、毛细管电色谱法[9]、气相色谱法[10]、荧光光谱法[11]、液质联用法[12-13]。本研究使用SPE/HPLC配套ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱，先采用固相萃取法对样品进行前处理，再用具有阵列检测器(DAD)的高效液相色谱仪分析检测，快速实现以上三种微量有机物的同时测定。相比于传统的液液萃取法固相萃取(SPE)可以提高分析物的回收率，减少样品预处理过程，具有省时省力、重现性好、污染程度小[14]等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器设备：1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司生产；SPE-DEX4790 型固相萃取仪，美国Horizon TechnoLogy 公司生产；AtLantic C18 Disk 固相萃取膜(47 mm),北京豫维科技有限公司生产；色谱柱采用ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5 μm)，美国安捷伦公司生产。

标准品：MC-LR 溶液标准样品(SB05-287-2012)，20 mg/L，农业部环境保护科研检测所提供；灭草松溶液标准样品(SB05-107-2008-2)，1 000 mg/L，农业部环境保护科研检测所提供；2,4-D 标准样品(GSB05-2654-2010),100 mg/L，农业部环境保护科研检测所提供。

实验试剂：配制标准品和样品分析所用到的甲醇、乙腈、三氟乙酸除另有规定外均为色谱纯。

1.2 实验方法

采用固相萃取技术富集水中的MC-LR、灭草松和2,4-D，用甲醇洗脱，将洗脱液浓缩收集后，再用具有二极管阵列检测器(DAD)的高相液相色谱仪进行分离检测。

1.2.1 标准溶液配制

混合标准中间液配制：如表1 所示，将MC-LR、灭草松和2,4-D 标准溶液用甲醇稀释，配制成浓度分别为1.00、2.00和2.00 mg/L混合标准中间液。

表1 标准系列浓度 /(mg·L-1)

标准使用液配制：分别取混合标准中间液50.00、100.00、200.00、300.00 和400.00 μL用甲醇定容至1.00 mL。

1.2.2 实际试样制备

按照《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750.8-2006 水样采集方法，用2.5 L 具塞棕色玻璃试剂瓶采集生活饮用水水样，低温避光保存。

样品前处理：每份采集水样取1 L，加入7 mL 甲醇，5 g 氯化钠来提高方法回收率。同时在待测水样中加0.1 g 硫代硫酸钠(Na2S2O3)，用以消除水样中氯类消毒剂的影响。

将做好前处理的水样使用固相萃取仪进行固相萃取：上样1 L，C18萃取膜依次用乙酸乙酯、丙酮、甲醇和纯水活化，干燥5 min，用甲醇进行3 次洗脱，收集好洗脱液（约20 mL）后，设定温度45 ℃进行氮吹浓缩，待测水样经过固相萃取浓缩至5.00 mL。处理好的试样直接进样。

1.2.3 空白试样制备

制备空白试样作为对照组，消除不确定性因素的干扰，以提高结果的可信度，对照组试样的制备过程与实际试样组制备过程保持一致。实际试样制备中使用到的试剂取超纯水代替。

1.2.4 色谱条件优化

色谱柱选择：使用较为经济耐用的ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱。

流动相：流动相组成为超纯水62%，乙腈(0.10%三氟乙酸)38%。使用甲酸、磷酸、三氟乙酸分别作为添加剂进行样品分析，结果显示采用三氟乙酸作为添加剂能更好地改善三种化合物的峰形，克服峰展宽和拖尾问题，提高色谱分离效果。

流速的选择：在柱温35℃流速为0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2 mL/min 下分别察看分离效果，结果显示流速设定为0.7 mL/min 时三种化合物的分离度较其他流速下更好，且可在15 min 内全部出峰。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的优化

化合物自身性质与色谱体系中所使用到的流动相种类等都会影响化合物吸收峰的波长、强度以及色谱峰形状等。在设定的流动相和流速下收集以上三种化合物210～400 nm的吸收光谱见图2。MC-LR在238 nm 有强吸收峰，约1.0 mAU；灭草松在215 nm 有强吸收峰，在238 nm有较强吸收峰约1.5 mAU；2,4-D在210 nm 有强吸收，在238 nm 有较强吸收峰，强度约1.0 mAU。虽然灭草松和2,4-D在深紫外附近有强吸收，但该区域基线噪音约为238 nm 附近的10 倍。故按照检测波长213 nm,215 nm,230 nm,238 nm 分别进样，得到图3。由图3 可知，在213 nm 和215 nm处灭草松和2,4-D 的峰面积很大，但基线波动也很大，在这个噪声下MC-LR 几乎被掩盖了。230 nm 和238 nm 相对比，238 nm 的峰形更为对称，故最终选择238 nm作为本实验方法的检测波长。

图2 三种化合物紫外吸收光谱图

图3 同浓度下不同波长时三种化合物峰和基线对比图

2.2 标准曲线、线性范围和检出限

配制浓度为1.00 mg/L的三种物质的单标和混合标准中间液分别进样，确定每种组分的保留时间和分离度。取处理好的样品1.0 L 注入到HPLC 系统中，在实验选定的色谱条件下进行分析，基线无干扰，各待测物分离度和峰形都很好，三种化合物都能够实现理想的分离效果。

根据表1中的标准溶液浓度，每个浓度平行测定3 次，取平均值。保留时间为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线如图4 所示。图中微囊藻毒素-LR保留时间为7.707 min、灭草松保留时间为11.910 min、2,4-D 保留时间为12.999 min。相关分离度为8.712和2.061。

图4 三种化合物的标准色谱图

用三种化合物的第一组数据的标准偏差计算方法检出限(MDL)，浓缩倍数200 倍。最低检出限限（方法最低检测质量浓度）等于4 倍MDL。表2 为三种农残的直线回归方程、相关系数和检出限。

表3 校准曲线表

2.3 方法的精密度与加标回收率

回收率: 未检出的实际水样中，加入标准溶液，计算回收率。MC-LR、灭草松和2,4-D 三种物质加标回收率测得值在85%～104%之间。采用本方法，MC-LR、灭草松和2,4-D 最低本底值质量浓度分别小于0.50 μg/L、0.50 μg/L和0.60 μg/L。

精密度:为了进一步验证方法的准确性，在未检出的实际水样中，分别按照标准曲线上第二个和第四个点的浓度加入标准溶液，连续检测7 次，计算标准偏差，取平均值，得到精密度。通过对高低浓度的数据分析，精密度均在2.6%～ 7.7%之间，满足国标GBT14848-2017 地下水质量标准[15]和GB3838-2002地表水环境质量标准[16]。

2.4 实际水样的测定

应用本方法对大同市自来水公司各水厂出厂水和管网水，共9个水样进行了MC-LR、灭草松和2,4-D的同时测定，由于响应值小，色谱图上未出峰，所以按照小于检出限报出，即测定水样中MC-LR、灭草松和2,4-D的含量分别在0.123、0.118和0.151 μg/L以下。说明近几年大同市通过源头治理，水生态环境得到良好改善。

3 结论

大同市饮用水结构为重地下水（67.7%）、轻地表水（引黄工程33.3%），地下水开发利用程度较高。检测水样来自二、六、七、八水厂和口泉供水处、黄河水厂、御东加压站以及两个管网点，共9 份出厂水和管网水样。

建立了MC-LR、灭草松和2,4-D 的固相萃取-液相色谱检测方法，固相萃取能更有效地将分析物与干扰组分分离，在实验设定的色谱参数下可在15 min内同时检测饮用水中的上述三种化合物，各组分的标准曲线的线性相关系数均大于0.999，回收率在85%～104%之间，方法的精密度与加标回收率都能满足国家标准GB5749-2006 生活饮用水卫生标准[17]的要求。本方法改进了流动相，使得色谱峰形更好；使用了更为经济耐用的色谱柱，提高了检验效率，适用于生活饮用水中痕量MC-LR、灭草松和2,4-D的富集批量检出。