高效液相色谱法测定披针叶黄花中黄酮含量

刘明地，刘继超，李学翠，王秋红，宋 萍,2,3

(1.青海民族大学化学化工学院，青海西宁 810007；2.青藏高原资源化学与生态环境保护国家民委重点实验室，青海西宁 810007;3.青海资源化学研究所，青海西宁810007）

披针叶黄花(T.1anceolata R.Br.)又名牧马豆、野决明，系豆科(Leguminoseae)野决明属(Thermopsis)多年生草本植物，分布于中国东北、华北及西北广大地区。喜生于湿润的丘陵、草原和沙地，也见于河岸及砾质戈壁。披针叶黄花叶量大；粗蛋白质含量高，据青海畜牧科学院分析，开花期最高达27.93%，结果期也有15.41%[1]。披针叶黄花全株有去痰止咳、止痛、止血之功效，可为药用[1]。

黄酮类化合物（flavonoids），原是指以2-苯基色原酮为骨架衍生的一类化合物的总称,现泛指两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物，即具有C6-C3-C6结构的一类化合物的总称。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、保护心血管、降压、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性和药理作用，是广泛存在于植物界的一大类天然产物[2-3]。黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐，目前国际上对黄酮类化合物的研究开发十分活跃，为黄酮类化合物在医药、保健食品、化妆品等方面的应用提供理论依据[4]。其中对黄酮提取工艺的研究是一个重要的内容。黄酮的提取方法有：热水提取法[5-6]、碱性水或碱性稀醇提取法[7-8]、微波辅助萃取[9-11]、超声波辅助萃取[10，12]、酶解法[11，13-14]、大孔树脂吸附法[11-13]、超滤法[11，13-14]、超临界流体萃取法[10-11，13-14]、有机溶剂提取法[10-13]等。其中有机溶剂提取法是国内外使用最广泛的方法，主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类物质。有机溶剂主要用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚等，最常使用的是乙醇，即醇提法。该法对设备要求简单，产品得率高。此外黄酮含量的测定是一个重要的内容，黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。而披针叶黄花作为豆科植物其黄酮含量相对较高，药用价值大。本实验以芦丁为标准品绘制标准曲线，单因素实验和正交实验相结合的方法选出最佳提取条件，用高效液相色谱法测定披针叶黄花中黄酮含量。

1 样品与试剂

1.1 样品与试剂

披针叶黄花（自采，阴干粉碎）；无水乙醇（分析纯，≥99.7%，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，≥99.99%，天津市大茂化学试剂厂）；乙腈（色谱纯，≥99.9%，天津市光复科技发展有限公司）；磷酸（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；芦丁标准品（固体UV≥98%，上海源业生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪（Agilent Technologies12608）；分析天平（XS-125，济南欧威腾生物科技）；超声波清洗器（DL-360A，上海之信仪器有限公司）；高速中药粉碎机（XFB-400，吉首市中诚制药机械厂）。

2 实验过程

2.1 标准品溶液的配制及标准曲线的绘制

2.1.1 芦丁储备液的配制

准确称取15.00 mg 芦丁标准品，用甲醇（色谱级）溶解并定容于100 mL的容量瓶中，配制成浓度为0.15 g/L的储备液，混匀，备用。

2.1.2 芦丁标准液的配制

分别移取0.1、0.2、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 储备液，用甲醇定容至10 mL 的容量瓶中，经孔径为0.45 μm 有机微孔滤膜过滤（针头式的有机膜配合一次性注射器过滤，将标准溶液吸入带有针头式有机膜的注射器内，推注射器进行过滤），备用。芦丁储备液、0.03 g/L、0.045 g/L 和0.09 g/L 的标准液在360 nm下的高效液相色谱图见图1。

图1 不同浓度标准溶液高效液相色谱图

2.1.3 芦丁标准曲线的绘制

取芦丁标准液5 μL，采用C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈∶0.4 %磷酸水溶液=20∶80 进行等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测器检测波长360 nm，检测时间为15 min。以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，标准曲线图如图2。

图2 芦丁标准曲线图

2.2 最优提取条件的选择

2.2.1 不同提取方法的考察

2.2.1.1 超声法

称取披针叶黄花2.0000 g，于锥形瓶中加入100 mL浓度为80%的乙醇，摇匀，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）2 h，冷却至室温，摇匀，抽滤并收集滤液，经高效液相色谱仪测定得到该滤液的色谱图（见图3a），计算浓度。

2.2.1.2 索氏法

称取披针叶黄花2.0000 g，装入备好的滤纸筒中，置于索氏提取器中，加入100 mL 浓度为80%的乙醇，85 ℃水浴加热，提取2 h，冷却至室温，摇匀，抽滤并收集滤液备用，用高效液相色谱仪测定得到该滤液的色谱图（图3b），计算浓度。

2.2.1.3 热回流法

称取披针叶黄花2.0000 g，置于圆底烧瓶中，加入100 mL 浓度为80%的乙醇，85 ℃水浴加热，热回流2 h，冷却至室温，摇匀，抽滤，用高效液相色谱仪测定该滤液的色谱图（图3c），计算浓度。

图3 不同提取方法提取液的高效液相色谱图

比较三种提取方法提取液的高效液相色谱图峰面积可知：热回流法（57.2 mAU·s）＞索氏提取法（47.0 mAU·s）＞超声提取法（37.4 mAU·s）。热回流提取的峰面积最大，结合标准曲线得热回流提取液中黄酮的含量最多。故热回流法提取效果最好，因此本实验选用热回流法提取。

2.2.2 溶剂浓度的考察

分别用100 mL 50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇热回流提取2 h，收集提取液，用高效液相色谱法测得样品的峰面积，考察溶剂浓度对提取效果的影响，如图4 所示。由图可知，乙醇浓度为60%的提取液的峰面积最大，提取效果最佳；50%的乙醇次之，随后为70%的乙醇，浓度为90%的乙醇提取效果最差。故以50%、60%、70%的乙醇作为考察溶剂的浓度三个水平进行正交实验。

2.2.3 正交试验

以A（浸泡时间）、B（提取时间）、C（溶剂体积）、D（乙醇浓度）等4 个对提取效果影响较大的因素作为主要影响成分，以提取液黄酮含量为考察指标，研究披针叶黄花中提取黄酮的最优条件，设计正交实验见表1。

表1 披针叶黄花提取黄酮的正交实验及结果

由表1中极差R判断出各个因素对披针叶黄花中提取黄酮提取率的影响顺序为：C＞A＞B＞D，也就是说用乙醇回流法从披针叶黄花中提取黄酮，溶剂体积对黄酮提取率的影响最为明显，其次是浸泡时间，随后是提取时间，而溶剂浓度的影响最小。再比较K值可知：最优提取条件为：A1B3C3D1，即最佳工艺条件为浸泡0 h，回流时间3 h，，溶剂体积130 mL，乙醇浓度50%。

2.3 药材披针叶黄花中黄酮含量的测定

取披针叶黄花2.0000 g，置于烧瓶中加入130 mL浓度为60%的乙醇，85 ℃水浴加热3 h，放冷，摇匀，进行抽滤。在360 nm 的波长下测定其峰面积，高效液相色谱图见图5。代入标准回归方程可得浓度，经计算后得到披针叶黄花原药材中总黄酮含量。上述溶液的峰面积值为125.3 mAU·s，对应的浓度为0.0417 g/L，则2.0000 g 披针叶黄花中含有5.4210 mg的黄酮。

图5 最优提取工艺下提取液的高效液相色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 加标回收实验

在样品的基质中添加芦丁的标准液进行回收实验，是来验证分析方法可靠性和精密度重要的手段。本研究采用在混匀的披针叶黄花提取液中定量的添加5 个不同浓度的芦丁标准品，经5 次平行提取、测定，计算回收率。表4列出了在披针叶黄花中添加的5个标样的回收率。

由表2 结果可得，样品的平均回收率为99.20%，RSD为1.09%，所以采用液相色谱紫外检测器测定黄酮结果可靠。

表2 加标回收实验结果（n＝5）

2.4.2 精密度实验

取同一浓度标准品溶液，重复进样6次，按上述高效液相色谱条件进行测定，得峰面积分别为141.8、137.9、138.1、139.9、137.8、137.8 mAU·s，RSD=0.0115%，表明精密性良好。

2.4.3 稳定性实验

取同一披针叶黄花提取液在相同色谱条件下，于0，1，2，3，4，5，6 h进样测定，得面积分别为71.9、73.5、71.5、73.4、71.9、73.5 mAU·s，RSD=0.0130%（n=6），表明提取液在6 h内稳定。

3 结论

披针叶黄花资源丰富，全株入药，能祛痰、止咳、有兴奋呼吸、升高血压的功效，主治祛痰止咳。作为黄酮类化合物因具有抗氧化、降糖降脂、保肝等生物学功效而在糖尿病、非酒精性脂肪肝、肥胖等慢性非传染性疾病防治中备受关注[15]。

本实验通过提取方法考察实验选出最佳提取方法为热回流法，设计正交实验确定最佳提取工艺条件为浸泡0 h，回流时间3 h，溶剂体积130 mL，乙醇浓度50%。采用C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈∶0.4%磷酸水溶液＝20∶80 进行等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测器检测波长360 nm，测定2.0000 g 披针叶黄花中含有5.4210 mg 的黄酮。目标色谱峰分离效果良好、精密度稳定性和回收率均符合要求。为后续研究披针叶黄花中总黄酮的含量提供依据。本研究建立的黄酮类成分含量测定方法简单、准确，适用于所有样品的含量测定。

由于时间和条件的限制，本课题还有一些问题需要进一步研究。如还需进一步考察其它提取方法、提取次数、提取温度等因素对披针叶黄花中黄酮提取的影响，以及其他流动相的洗脱效果。