T细胞受体γ位点反义RNA 1、人抗原R、三元基序家族蛋白21、缺氧诱导因子-1α在结直肠癌组织中的表达及临床意义△

柴小兵，褚菲菲，肖兴国，吴慧丽

郑州大学附属郑州中心医院消化内科，河南省结直肠癌诊治医学重点实验室，郑州市结直肠癌诊治与研究重点实验室，郑州 450007

结直肠癌是临床中常见的一种消化系统恶性肿瘤，其发病与大肠腺瘤、遗传因素、生活习惯等存在密切关系，常见的临床症状为腹痛、便血以及大便性状改变等，多见于中老年人群，男性发病率高于女性，近年来结直肠癌的发病率呈上升及年轻化趋势[1]。目前，手术是治疗结直肠癌的主要方法之一，早期明确诊断并及时给予针对性治疗可以使患者获得较好预后。研究指出，复发转移是影响结直肠癌患者预后的主要因素。结直肠癌的复发转移机制复杂，某些与肿瘤相关的因子可能起到重要作用[2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与恶性肿瘤有关，T细胞受体γ位点反义RNA 1（T cell receptor gamma locus antisense RNA 1，TRG-AS1）是近年来新发现的一种恶性肿瘤相关lncRNA[3]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）不仅参与恶性肿瘤新生血管生成，而且在能量代谢过程中具有重要作用[4]。人抗原R（human antigen R，HuR）是胚胎致死性异常视觉基因的蛋白质产物，可以对mRNA的不稳定性进行调节，与多种恶性肿瘤的发生有关[5]。三元基序家族蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM21）是TRIM家族的重要成员，在肿瘤细胞生长和增殖等方面起到重要的调控作用[6]。本研究分析 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α在结直肠癌组织中的表达及临床意义，旨在为结直肠癌的治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年6月于郑州大学附属郑州中心医院接受手术治疗的结直肠癌患者。纳入标准：①经病理检查确诊为结直肠癌；②初次行手术治疗；③术前未接受过生物免疫治疗或放化疗等；④临床资料及随访资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤；②合并免疫系统疾病、心脑血管疾病或血液系统疾病；③合并全身性感染。依据纳入和排除标准，本研究共纳入103例患者。其中，男性68例，女性35例；年龄34～77岁，平均（54.97±10.68）岁。收集103例结直肠癌患者的结直肠癌组织及癌旁组织（距结直肠癌组织5 cm以上），所有标本均置于低温保存管，经液氮处理后置于-80℃冰箱中保存备用。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组织化学染色法检测HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况及结果判定 石蜡包埋处理标本，连续切片，厚度为4 μm左右；将切片脱蜡和水化，通过高压锅修复抗原，时间为2 min；封闭液孵育60 min；滴加HuR、TRIM21、HIF-1α一抗工作液50 μl，4℃孵育过夜；磷酸盐缓冲液冲洗3次，滴加二抗工作液50 μl，室温下孵育30 min；加入二氨基联苯胺显色，分别应用苏木精及梯度乙醇进行复染和脱水，然后进行固封和镜检。采用荧光倒置显微镜观察染色结果。阳性细胞比例评分：＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分和染色强度评分相乘，0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为中等阳性，9～12分为强阳性，其中1～9分为阳性。

1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测TRG-AS1相对表达量 应用Trizol试剂提取总RNA，然后应用PrimeScript逆转录酶试剂盒将RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green PCR试剂盒进行基因扩增，引物由武汉擎科生物技术有限公司设计合成，TRG-AS1上游引物5'-ATGAAGAAGCCGCGAAGTGT-3'，下游引物 5'-CACACCCTAATACACATGCCCT-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物5'-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3'，下游引物5'-GGCGCCCAATACGACCAAAT-3'。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃延伸5 min。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法检测TRG-AS1的相对表达量。

1.3 随访方法

出院后第1天开始随访，通过门诊复查或电话、微信等电子通讯的方式进行随访，随访截止时间为2022年3月，以患者死亡或复发为随访终点。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或McNemar检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况的比较

结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量为（1.50±0.50），明显高于癌旁组织的（0.71±0.19），差异有统计学意义（t=9.281，P＜0.01）。结直肠癌组织中HuR、HIF-1α阳性率分别为65.05%（67/103）、76.70%（79/103），分别明显高于癌旁组织的10.68%（11/103）、14.56%（15/103），差异均有统计学意义（P＜0.01）。结直肠癌组织中TRIM21阳性率为30.10%（31/103），明显低于癌旁组织的91.26%（94/103），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况的比较

不同分化程度、淋巴结转移情况、血管侵犯情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=14.116、t=4.688、t=3.038，P＜0.05）；不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HuR阳性率比较，差异均有统计学意义（χ2=5.864、9.938、7.237，P＜0.05）；不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRIM21阳性率比较，差异均有统计学意义（χ2=45.537、7.908、5.859，P＜0.05）；不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HIF-1α阳性率比较，差异均有统计学意义（χ2=5.498、5.804、5.499，P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α的表达情况

2.3 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况结直肠癌患者预后的比较

随访至2022年3月，103例患者中死亡36例，生存67例，生存率为65.05%。以TRG-AS1相对表达量的中位值为界，中位值以上为高表达，中位值及以下为低表达；TRG-AS1低表达患者的累积生存率为55.6%，高于TRG-AS1高表达患者的31.5%，差异有统计学意义（χ2=6.493，P=0.011）。HuR阴性患者的累积生存率为56.9%，高于HuR阳性患者的37.0%，差异有统计学意义（χ2=4.824，P=0.028）。TRIM21阴性患者的累积生存率为22.4%，低于TRIM21阳性患者的59.0%，差异有统计学意义（χ2=5.827，P=0.015）。HIF-1α阴性患者的累积生存率为72.0%，高于HIF-1α阳性患者的36.6%，差异有统计学意义（χ2=4.422，P=0.035）。（图1）

图1 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况结直肠癌患者的生存曲线

3 讨论

结直肠癌具有较高的发病率及病死率，特别是中晚期患者，即使接受手术、化疗、放疗等综合治疗，其预后情况仍不容乐观。近年来，随着生物信息学、基因检测技术的发展，多种新型肿瘤标志物逐渐被发现[7]。结直肠癌发病的分子机制尚未明确，仍需要进一步研究其治疗靶点。

本研究结果显示，结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量明显高于癌旁组织，说明TRG-AS1可能作为一种促癌基因参与结直肠癌的发生发展过程。lncRNA异常表达在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，有学者指出，TRG-AS1能够通过影响微小 RNA（microRNA，miRNA）-877-5p对Zeste 12同源物1抑制因子2（suppressor of zeste 12 homolog，SUZ12）的表达情况进行调控，从而促进胶质母细胞瘤进展[8]。He等[9]研究指出，TRG-AS1可以通过调控miRNA-543/Yes相关蛋白1信号通路促进舌鳞状细胞癌的发生。目前关于TRG-AS1在结直肠癌中表达上调的机制尚不清楚。分析其原因可能是TRG-AS1受其他转录因子调控或编码基因发生突变导致[10]。本研究结果显示，不同分化程度、淋巴结转移情况、血管侵犯情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明TRG-AS1表达水平与结直肠癌患者病情严重程度有关。研究表明，上皮-间充质转化在结直肠癌进展、转移和耐药中发挥重要作用，而TRG-AS1下调有效地抑制了上皮-间充质转化，TRG-AS1表达水平升高后对上皮-间充质转化的抑制作用减弱[11]。

据报道，许多转录因子参与了恶性肿瘤某些关键的生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、新生血管生成、免疫反应和转移等，与患者的生存率存在密切关系[12]。HuR是一种RNA结合蛋白，已被证明通过不同的转录后机制（如mRNA衰变和蛋白质翻译）调节多个基因的表达[13]。本研究结果显示，结直肠癌组织中HuR阳性率明显高于癌旁组织，不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HuR阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明HuR能够反映结直肠癌患者病情严重程度。B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、c-Myc、细胞周期蛋白D（cyclin D）和细胞周期蛋白A（cyclin A）基因为HuR的下游分子，这些基因均参与了细胞增殖和细胞周期等过程，如转录因子c-Myc可调节10%～15%的人类基因表达，在细胞增殖、分化、生长和存活过程中发挥重要作用；细胞周期蛋白是细胞周期的基本调节因子，在肿瘤发生中发挥重要作用，cyclin A是细胞通过S期所必需的[14]。HuR通过上调Bcl-2、c-Myc、cyclin D和cyclin A基因表达调节肿瘤细胞增殖和凋亡，促进结直肠癌的发生发展[15]。

TRIM21是TRIM超家族成员，已被发现是多种自身免疫疾病（如炎症性肠病、系统性红斑狼疮和风湿性疾病等）的关键调节因子，而且有研究证实，TRIM21是肝细胞癌中潜在的肿瘤抑制因子[16]。本研究结果显示，结直肠癌组织中TRIM21阳性率明显低于癌旁组织，说明结直肠癌中TRIM21发挥抑癌基因的作用。Zhou等[17]研究指出，TRIM21在结肠炎相关肿瘤中表达下调，通过调节肿瘤细胞增殖、黏附、组织重塑、血管生成以及炎症反应来负调节结肠上皮癌变，进而降低结直肠癌的发生风险。本研究结果显示，不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRIM21阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明TRIM21可反映结直肠癌患者病情严重程度。其原因可能是TRIM21能够介导蛋白酶体降解以及Snail蛋白泛素化，调节上皮-间充质转化过程，进而抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移[18]。

HIF-1α在恶性肿瘤对缺氧的反应中发挥重要作用，在缺氧条件下HIF-1α信号被激活，参与肿瘤的侵袭、转移以及对放疗和化疗的抵抗[19]。本研究结果显示，结直肠癌组织中HIF-1α阳性率明显高于癌旁组织，说明结直肠癌中HIF-1α发挥促癌基因的作用。HIF-1α表达上调与抑癌基因突变、促癌基因激活有关，还可能与组织氧浓度降低有关。本研究结果显示，不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HIF-1α阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明HIF-1α水平同样可反映结直肠癌患者病情严重程度。其原因可能是HIF-1α表达上调可以促进上皮-间充质转化，进而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力；另外，在缺氧状态下，HIF-1α也可以通过诱导p53表达促进肿瘤细胞增殖[20]。本研究还发现，TRG-AS1低表达、HuR阴性、TRIM21阳性、HIF-1α阴性结直肠癌患者的累积生存率分别高于TRGAS1高表达、HuR阳性、TRIM21阴性、HIF-1α阳性患者（P＜0.05），说明 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况与结直肠癌患者预后有关，可能作为评估结直肠癌患者预后的标志物。

综上所述，结直肠癌组织中TRG-AS1、HIF-1α及HuR表达均升高，TRIM21表达降低，TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况与结直肠癌侵袭、转移及患者预后密切相关，对评估结直肠癌患者病情及预后具有一定的临床价值。