高压二氧化碳对人冠状病毒（hCoV-229E）的消杀效果

宁 鹏，杨 东，廖小军，魏凡华 ，饶 雷, ，毕玉海

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.中国科学院流感研究与预警中心，中国科学院微生物研究所，病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，农业农村部果蔬加工重点实验室，食品非热加工北京市重点实验室，北京 100083；4.中国科学院大学，北京 100049）

2019新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）自出现以来，至今仍在全球大流行[1]。截至2022年6月13日，造成全球约5.3亿人感染，630余万人死亡（https://covid19.who.int/）。随着病毒的广泛传播，SARS-CoV-2不断发生突变，德尔塔及奥密克戎等变异毒株层出不穷，病毒感染力和致病力不断变化[2-5]，严重威胁人类健康及公共卫生安全。

冠状病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，分为α、β、γ、δ四个属。目前可以感染人的冠状病毒有人冠状病毒229E（human coronavirus 229E，hCoV-229E）、OC43（human coronavirus OC43，hCoV-OC43）、NL63（human coronavirus NL63，hCoV-NL63）、HKU1（human coronavirus HKU1，hCoV-HKU1）及严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）和SARS-CoV-2等7种冠状病毒，其中hCoV-229E、hCoV-NL63为α属，hCoV-OC43、hCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2为β属[6-9]。所有冠状病毒在复制、形态结构等方面都存在相似之处，但感染后的潜伏期和致病力有所差别[10]。

有研究表明，新冠肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）患者呼吸系统和消化系统均可排毒，且消化系统排毒时间更长[11]；而SARS-CoV-2可以通过消化系统感染实验动物[12-13]，表明SARSCoV-2存在粪口传播的风险。同时，在冷链温度条件下（4 和-20 ℃），SARS-CoV-2可以在三文鱼、牛肉和猪肉表面存活一段时间[14]；而在我国进口的冷链运输食品包装表面检测出SARS-CoV-2核酸并分离到活病毒，提示SARS-CoV-2存在冷链传播途径[15-17]。此外，海洋中多种鱼类血管紧张素转化酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）受体与人ACE2受体的氨基酸序列同源性较高，存在感染SARS-CoV-2的风险[18]。以上研究结果表明，在“新冠肺炎”疫情防控工作中不仅要防止“人传人”，还要防止“物传人”，需要加强对冷链食品及外包装的消杀工作。

冠状病毒结构较简单，易受温度、紫外线辐射、pH和渗透压等环境因素影响，诱导病毒结构蛋白构象发生变化，破坏病毒囊膜或降解病毒核酸，影响病毒稳定性或丧失感染性[19]。研究表明，冠状病毒在56 ℃的条件下30 min即可灭活；在70%乙醇作用10 min、丙醇作用90 s或0.5%戊二醇作用2 min即可丧失感染性[20]。由于食品中严禁添加非食用成分，常规的消毒剂无法在食品表面使用，而传统的巴氏杀菌、高温杀菌等热杀菌技术对冷链食品处理后，会引起食品中营养物质流失、食品颜色改变，影响食品口感及风味[21-23]。高压二氧化碳（high-pressure carbon dioxide，HPCD）是一种新型非热杀菌技术，可有效克服传统热杀菌技术的弊端，在较低压力（＜50 MPa）和较低温度（5～60 ℃）条件下利用CO2对食品进行处理，可实现杀菌钝酶效果，同时保留食品原有风味、口感及营养成分[24-26]。HPCD处理过程温度低、杀菌效果好，泄压过程CO2吸热产生的冷冻效应可实现对冷冻产品品质的维持，使其在冷链食品消杀方面具有较好的应用潜力。

由于SARS-CoV-2需要在生物安全三级实验室中进行操作，受试验条件限制；而hCoV-229E的稳定性等生物学特性与MERS-CoV、SARS-CoV等冠状病毒较为相近[27]，并可以在生物安全二级实验室进行操作。因此，本研究选用hCoV-229E作为SARSCoV-2的替代毒株，探究HPCD对冠状病毒的消杀效果，为HPCD应用于冷链食品及包装的消杀提供理论依据，为疫情常态化防控中冷链食品的消毒和管理措施提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三文鱼肉、虾壳、聚乙烯类包装材料 中国农业大学食品科学与营养工程学院提供；人肝癌细胞（Huh-7） 中国医学科学院基础医学研究所；人冠状病毒229E（毒株名：VR-740） 赵金存教授惠赠，实验室培养保存；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）GIBCO公司；青霉素钠、硫酸链霉素 山东鲁抗医药股份有限公司；生理盐水 山东华鲁制药有限公司；二氧化碳（纯度≥99.5%） 河南沂之源气体销售有限公司。

CAU-HPCD-1间歇式HPCD杀菌装置 中国农业大学专利产品（专利号ZL200520132590.X）；5424R高速冷冻离心机 Eppendorf公司；ME-E涡旋仪大龙兴创实验仪器有限公司；MCO-170AICUVLPC CO2细胞培养箱 普和希株式会社；LEICA DMi1倒置显微镜 德国徕卡公司。

1.2 实验方法

1.2.1 hCoV-229E病毒增殖 取100 μL hCoV-229E病毒液加入Huh-7细胞中，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，孵育结束后对细胞培养瓶中补充细胞维持液（DMEM培养基中含终浓度为100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素、2% FBS），于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中继续培养。每24 h观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）情况；当细胞出现80%以上CPE时收获病毒培养液[20]。

1.2.2 HPCD对hCoV-229E消杀条件的研究 50 mL离心管中加入5×103.5TCID50的hCoV-229E病毒液（总体积5 mL，生理盐水稀释）；在不同的消杀条件下（见表1）使用HPCD对hCoV-229E进行处理，每组进行三次重复试验。消杀处理方法如下：试验组标记后放入预热（预冷）的间歇式HPCD杀菌装置反应釜中，关闭反应釜通入CO2，加压至预设压力后进行保压、保温，到达保压时间后对反应釜泄压，完成后取出置于冰上；将不加压、相同温度处理的对照组放入反应釜，不通入CO2，使用间歇式HPCD杀菌装置对样品进行热处理；所有样品处理完成后进行TCID50测定。

表1 HPCD对hCoV-229E的处理条件Table 1 Treatment conditions of HPCD for hCoV-229E

1.2.3 HPCD对食品及聚乙烯类包装材料表面hCoV-229E的消杀效果 三文鱼肉、虾壳、聚乙烯类包装材料表面滴加103.5TCID50的hCoV-229E病毒液（滴加病毒液的总体积为100 μL），根据1.2.2确定的HPCD最佳消杀条件，对三文鱼肉、虾壳、聚乙烯类包装材料等样品（三文鱼肉边长为1 cm×1 cm×1 cm，为块状；虾壳、聚乙烯类包装材料边长为1 cm×1 cm，为片状）进行消杀处理，同时设立相对应不加压的相同温度处理的对照组；每组三次重复试验，试验操作方法同1.2.2。HPCD对样品消杀后，向盛放样品的离心管中加入900 μL病毒稀释液（DMEM培养基中含终浓度为100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素），涡旋振荡2 min，回收上清液后在高速冷冻离心机中7000 r/min离心10 min，取离心后的上清液使用0.22 μm滤器过滤，然后滴定TCID50[18]。TCID50计算方法如下：

待滴定样品的不同稀释度稀释液加入96孔板细胞后，培养至120 h，显微镜观察并记录96孔细胞培养板中的细胞病变情况，按照Reed-Muench法[28]计算病毒的TCID50，计算公式如下：

Log10TCID50=高于50%感染率的病毒稀释度对数+相应距离比×稀释系数的对数

1.3 数据处理

本试验所有数据使用GraphPad Prism 8进行统计，使用T-test对数据进行统计学分析，当P＜0.05时具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 hCoV-229E在Huh-7细胞中增殖

如图1所示，接种病毒24 h后，与对照Huh-7细胞（图1a）相比，接种hCoV-229E的细胞（图1b）无明显细胞形态差异；接种病毒96 h后，与对照Huh-7细胞（图1c）相比，接种hCoV-229E的Huh-7细胞（图1d）出现细胞皱缩、脱落等典型细胞病变。

图1 hCoV-229E接种Huh-7细胞后细胞病变观察结果（200×）Fig.1 Cytopathic effects of the hCoV-229E infected Huh-7 cells (200×)

2.2 HPCD对hCoV-229E的最佳消杀条件

HPCD在6.3 MPa压力和不同的温度（10、25及37 ℃）条件下，分别对5×103.5TCID50的hCoV-229E病毒液处理15 min。由图2可知：试验组A、试验组B及试验组C1之间病毒滴度无显著差异（P＞0.05），与对应的相同温度处理对照组相比，各试验组经HPCD处理后hCoV-229E病毒滴度有下降趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；在6.3 MPa压力、10 ℃条件下（试验组D）对5×103.5TCID50的hCoV-229E病毒液进行30 min处理，发现试验组与对照组差异显著（P＜0.05）；在相同压力和相同温度（10 ℃）消杀条件下，试验组A（处理15 min）和试验组D（处理30 min）之间的病毒滴度没有显著差异（P＞0.05），提示在10 ℃低温条件下延长HPCD处理时间不是HPCD消杀hCoV-229E的主要因素；在37 ℃处理15 min条件下，提高HPCD处理压力，由6.3 MPa（试验组C1）提升至10 MPa（试验组C2），结果显示提高压力后试验组C2的病毒滴度较试验组C1显著下降（P＜0.05），较对照组C相比极显著下降（P＜0.01）。试验结果表明，提高CO2的压力会提升HPCD对hCoV-229E的消杀效果。综上，HPCD对hCoV-229E的最佳消杀条件为37 ℃、10 MPa消杀15 min。

图2 不同的HPCD处理条件对hCoV-229E滴度的影响Fig.2 Effects of different HPCD treatment conditions on virus titers of hCoV-229E

2.3 HPCD对食品及包装材料表面hCoV-229E消杀效果

HPCD在37 ℃、10 MPa的条件下，对表面含103.5TCID50hCoV-229E的三文鱼肉、虾壳及聚乙烯类包装材料处理15 min。结果如图3所示：与不加压的温度处理对照组相比，三文鱼肉试验组的病毒滴度显著下降（P＜0.05），虾壳及聚乙烯类包装材料试验组病毒滴度极显著下降（P＜0.01）。说明HPCD在37 ℃、10 MPa的条件下对表面含有hCoV-229E的三文鱼肉、虾壳和聚乙烯类包装材料处理15 min后，对hCoV-229E具有一定的消杀效果；同时，相同HPCD的处理条件对虾壳及包装材料表面hCoV-229E的消杀效果要强于对三文鱼肉表面病毒的消杀效果，原因可能是由于三文鱼肉蛋白质含量较高[29]，影响HPCD对三文鱼肉中hCoV-229E病毒的消杀效果。

图3 HPCD对表面含有hCoV-229E的食品及包装材料的消杀效果Fig.3 Disinfection effects of HPCD against hCoV-229E virus on the surface of food and packaging materials

3 讨论与结论

HPCD是一种绿色环保、无毒无害的杀菌方式，对微生物具有良好的杀菌作用，广泛应用于食品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌及孢子等微生物的消杀[30-33]。温度和压力是影响HPCD消杀微生物的主要因素[34]。有研究发现，提高HPCD消杀的处理温度、压力及延长消杀时间可有效提高对微生物的消杀效果[35-36]。本研究发现，HPCD在6.3 MPa和处理15 min的条件下，提高处理温度（10、25和37 ℃）并不能显著提高消杀效果（P＞0.05），表明在6.3 MPa处理15 min条件下温度不是影响HPCD对hCoV-229E消杀效果的主要因素。此外，在10 ℃、6.3 MPa的条件下，延长HPCD的保压处理时间（由15 min延长至30 min）后发现，病毒滴度差异不显著（P＞0.05），提示在该条件下处理时间也不是HPCD对hCoV-229E消杀的主要因素。

在本研究中，使用37 ℃和10 MPa的试验条件对样品处理15 min，获得了较好的消杀效果。可能是由于相比气态的CO2，超临界状态下（Tc=31.1 ℃；Pc=7.38 MPa）的CO2具有较低表面张力，可以更好地渗透到微孔中，对微生物具有更高的杀灭作用[21,37]。Werenr等研究也证实超临界的CO2相比于气态的CO2对牛奶中的微生物具有更好的杀灭作用[38]。此外，食品中蛋白质含量也是影响HPCD消杀效果的另一个因素，对脂肪含量较高的食品的消杀效果较差[29]。本研究也发现，超临界状态的CO2对三文鱼肉样品表面的hCoV-229E有一定消杀效果，对虾壳和聚乙烯类包装材料表面病毒的消杀效果更佳。

冠状病毒对pH敏感，不同的pH条件会影响冠状病毒的刺突蛋白结构，进而影响刺突蛋白与受体结合能力。研究发现冠状病毒在25 ℃、pH=1或37 ℃、pH=3条件下放置1 h 可完全被灭活[39]。而CO2可以在水中溶解形成碳酸，降低水溶液的pH[40]。Spilimbergo等研究发现，使用HPCD在8 MPa、30 ℃的条件下处理5 min，可以使枯草芽孢杆菌悬液的pH降低至3.3，表明含水溶液经HPCD处理后，pH会明显降低[41]；因此，HPCD引起水溶液中pH的降低是对冠状病毒消杀的重要因素。

综上，本研究以人冠状病毒（hCoV-229E）为研究对象，优化确定了HPCD对人冠状病毒的最佳消杀条件为37 ℃、10 MPa处理15 min，发现消杀压力是HPCD消杀冠状病毒的重要因素。本研究得到的消杀参数可以应用于食品包装表面的消杀。对于冷链食品消杀，可以考虑进一步提高处理压力，一方面实现消杀效果的提升，另一方面利用泄压过程CO2吸热产生的冷冻效应实现对产品品质的维持。此外，为应对实际生产应用需求，未来需要开发处理容积大、自动化程度高、稳定性好的商业化设备，实现在中央厨房、大型食品生产工厂、生鲜食品集散地及海关进出口食品检测等场景推广应用，为疫情常态化防控形势下保障冷链食品安全起到一定作用。在后续研究中，将继续探究HPCD对冠状病毒的消杀机制，进一步完善HPCD对病毒的消杀理论。