响应面法优化鲜黄酒瓶内发酵工艺

葛松涛，寿泉洪，韩文凤，王 兰，沙如意 ，王珍珍，胡普信，毛建卫

（1.浙江工业职业技术学院黄酒学院，浙江绍兴 312000；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州 310023；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴 312000；4.浙江科技学院，浙江杭州 310023）

黄酒是世界三大发酵酒之一，是我国所独有的，以稻米、黍米、小米等为主要原料，经加麦曲等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒[1]。由于黄酒的原辅料和采用独特多菌种协同的双边发酵工艺，因此黄酒含有丰富的功能性成分，如多酚、多糖、多肽、γ-氨基丁酸等，使黄酒具有一定的调节肠道菌群、降血压等保健功效[2]。黄酒独特的原料和生产工艺，通过发酵过程中的微生物代谢、陈化储存过程的生化反应[3]，赋予黄酒酸、甜、苦、鲜、涩的口感[4]，丰富且复杂的风味[5-6]。口感与风味对黄酒的质量和风格起到重要的作用，也是影响消费者偏好的重要因素[1]。复杂的风味导致黄酒地域消费特征显著，主要市场向江浙沪集中，年龄向中老年集中[7]。

通过引导消费的方式实现消费区域与年龄突破不现实[7]，因此，开发适合现代青年生活习惯及口感的黄酒成为首选方案。目前，黄酒的研究主要集中在原料的选择、酒曲微生物种类、功能性成分及黄酒风味等[8-10]。而传统黄酒发酵结束后需经过澄清、灭菌等工序使其达到稳定，目前主流的灭菌工艺采用加热灭菌[11]，加热灭菌则会造成黄酒风味的损失，尤其使涩味的感官属性突出[1]。鲜黄酒发酵后不经高温灭菌[12]，因此鲜酒较热法杀菌酒口感更新鲜[13]。朱一松等[14]通过超滤膜截留黄酒中的大分子物质，得到纯生黄酒，颜色变浅香味淡爽。胡普信[12]采用先糖化后发酵，再经无菌过滤的工艺，生产得到较为爽口的纯生黄酒。但膜过滤法生产纯生黄酒，导致黄酒中蛋白质和氨基酸的含量下降，且对膜的要求较高，导致黄酒生产成本的上升。

瓶内发酵鲜黄酒是通过原料灭菌装瓶后，接入酵母发酵，发酵结束后不经灭菌直接进入消费终端，既能减少灭菌能耗又能保证产品的质量。由于发酵后的成品未被加热，成品呈多种复合香味且较为爽口[12]；同时发酵是在完全密闭的环境中进行，因此产生的二氧化碳会被溶解到黄酒中，赋予低度黄酒独特的风味[15]。本研究通过调整配方、发酵时间和温度，在前期单因素实验的基础上，通过Plackett-Burman试验，最陡爬坡试验，中心组合试验（Central Composite Design，CCD）的方法优化低度鲜黄酒发酵工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糯米 市售；黄酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司；α-淀粉酶（酶活2000 U） 无锡杰能科酶制剂公司；糖化酶（酶活50000 U） 张家港金源生物化工有限公司；矿泉水 华润怡宝饮料有限公司。

电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏金坛荣华仪器制造公司；BSP-250生化培养箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糖液制备与灭菌 按照吴殿辉[16]的方法制备初始发酵糖液，稀释至试验所需糖度装瓶后95 ℃水浴灭菌[12,16]，备用。

1.2.2 鲜黄酒发酵与耐压计算

1.2.2.1 鲜黄酒发酵工艺 称取0.2%安琪干酵母按

参考文献[17]方法35 ℃下活化，产生大量气泡后备用。按方法1.2.1制备的初始发酵糖液中接入已活化安琪酵母液，置于生化培养箱中按一定温度恒温培养，达到一定发酵时间后4 ℃保存备用。

1.2.2.2 鲜黄酒耐压计算 按照参考文献[12]的方法测量初始糖度和发酵终了结束糖度。按照参考文献[18]的方法计算瓶内压力，酿造中CO2计算可简化为：

式中：G：发酵液中CO2产生总量，%。

1.2.3 发酵工艺响应面试验

1.2.3.1 Plackett-Burman设计筛选 采用 Plackett-Burman设计法和Design-expert软件创建试验次数N=12的试验，对初始糖度（A，g/L）、装液量（C，mL）、水浴灭菌的时间（D，h）、接种量（F，mL）、发酵温度（G，℃）、发酵时间（J，h），6个因素进行考察，另设5个虚拟因素（B、E、H、I、K）以考察试验误差[19]，如表1所示，以感官评价分为响应值考察各因素对口感影响的显著性[20]。

表1 Plackett-Burman 设计因子水平及编码值Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.3.2 最陡爬坡试验 析因实验的初步估计常常远离实际最优点，需要以响应值变化的梯度方向为爬坡方向设计爬坡试验，根据各显著因素效应值的大小确定变化步长，以期快速、经济地逼近最大响应区域。根据Plackett-Burman试验结果，设计最陡爬坡试验[21]。

1.2.3.3 响应面试验 利用Design-expert软件在最陡爬坡试验的基础上进行3因素3水平的中心组合设计试验[22-24]，如表2所示，以得到最佳的发酵条件，提高感官评价分数。

表2 中心组合试验中变量及其水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.2.4 鲜黄酒感官评价

1.2.4.1 感官品评人员 品评人员分为两组选拔后统一培训[25-26]。一组由国家级黄酒评酒委员组成，作为专家品评小组，共4 人，其中男性3人，女性1人；另一组由19～22岁的浙江工业职业技术学院黄酒分院的青年学生组成，作为鲜黄酒潜在的消费者，共9人，其中男性3人，女性6人。

1.2.4.2 评价方法 品评共3轮重复，样品随机组合；分别将样品分轮次提供给品评员进行味觉和嗅觉的感官描述分析；每轮品评之间间隔时间15 min，提供纯净水给品评员漱口；品评员记录样品的味道和气味感官性质，并根据表3进行评分[26-28]。去掉一个最高分，去掉一个最低分后取算术平均值作为最终得分。

表3 成品黄酒评分标准（分）Table 3 Sensory evaluation (scores)

1.3 数据处理

每位品评人员每组数据重复测定2次，去掉每组评分最高分和最低分后取平均值；采用Design-Expert.V 8.0.6统计软件进行实验设计和数据分析统计，响应面图采用Design-Expert.V 8.0.6导出。

2 结果与分析

2.1 瓶内发酵耐压安全性计算

将根据Plackett-Burman试验设计和爬坡试验设计发酵得到的低度鲜酒按照方法1.2.2.2检测糖度。

如表4、表5所示，本试验中所采取的初始糖度最高为160 g/L，在实际操作中检测得到发酵结束糖度不低于40 g/L，根据实验方法1.2.2.2计算可得CO2含量＜0.58%，而成品啤酒按国家标准CO2含量在0.40%～0.65%之间，因此本项目所产生的CO2含量符合耐压安全标准。

表4 Plackett-Burman试验鲜酒糖度Table 4 The brix of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡试验鲜酒糖度Table 5 The brix of the steepest ascent method

2.2 Plackett-Burman设计筛选结果

根据前期单因素实验基础，选用试验次数N=12的试验设计，以感官评价为响应值。实验设计及结果如表6所示。

表6 Plackett-Burman 试验设计与结果Table 6 Design and results of Plackett-Burman test

对试验数据进行方差分析，Plackett-Burman试验结果采用Lenth法识别显著效应[22]，得到了因素标准化效应的半正态概率效应图（图1）以及因素标准化效应的帕累托图（图2）。由图1可看出，因素G、J、A的标准化效应点离拟合线较远，位于图右侧，故其为显著影响因素（P＜0.05），即影响感官评价的显著因素是发酵温度、发酵时间、初始糖度、接种量，各因素对感官评价影响程度的大小顺序为：发酵温度＞发酵时间＞初始糖度＞接种量。装液量和灭菌时间标准化效应点均较小，说明影响不显著。标准化效应的帕累托图（图2）进一步确定了效应的量值和重要性，因素G、J、A、F均超过了t值，为显著因子。

图1 鲜黄酒感官评价半正态概率效应图（α=0.05）Fig.1 Half-Normal plot of estimated main effects on sensory scores (α=0.05）

图2 鲜黄酒感官评价的标准效应帕累托图（α=0.05）Fig.2 Pareto chart of estimated main effects on sensory scores(α=0.05)

由表7可知，模型的P值为0.0122＜0.05表明显著，故该模型可靠，即该模型在被研究的整个回归区域拟合很好；决定系数R2=0.9214，说明相关性较好；校正决定系数R2Adj=0.8270表明，82.7%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释；通常情况下变异系数（CV）越低，实验的可信度和精确度越高，CV值等于8.67%，表示PB实验的可信度和精确度较好；精密度是有效信号与噪声的比值（Adeq Precisior），大于4.0视为合理[22]，本试验精密度达9.807。

表7 Plackett-Burman试验因素、水平及显著性分析Table 7 Factors, levels and significance analysis of Plackett-Burman test

通过对数据进行多元回归拟合，得到回归方程：Y=65.61+5.39A+4.01C-3.17D-4.36F-6.69G-6.24J。

2.3 最陡爬坡实验

由回归方程可知，因素A偏回归系数为5.39，表明因素A对感官评价分数的影响为正效应，即随着A因素的增加，感官评分呈上升趋势，应增加。同时由回归方程1可见，F、G、J因素为负效应，即对响应值的影响为负效应，应减小。但响应面试验时考察因素超过3个会使试验次数显著增加（3个因素为20次处理，4个因素为31次处理）。同时，因素F即接种量的效应在这4个因素中最小，因此舍弃对该因素的进一步优化[29]。由于最显著的因素是G，因此以G为爬坡单位。

爬坡实验从中心点开始出发[30]，一般而言减少接种量可降低成本，因此取低水平接种量10 mL。综合考虑成品酒的气泡含量、灭菌效果与成本等因素，装液量固定取195 mL，灭菌时间固定取2.5 h。设计及结果如表8所示。

表8 最陡爬坡实验设计及其结果Table 8 The steepest ascent method results

由表8可知，处理2的感官分数最高，因此以处理2为响应面试验的中心点。

2.4 CCD结果与响应面分析

根据最陡爬坡试验，以处理2为中心点实行CCD试验[31]，以感官分数为响应值。因为有3个自变量，为使拟合响应方程具有旋转性和通用性, 选择中心点实验数为6，星号臂长γ=1.682。实验方案及结果见表9。

表9 中心组合试验设计结果Table 9 Results of central composite design

通过对数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项式方程：Y=95.67-2.25A+2.06B-2.62C-1.62AB-2.62AC-0.12BC-3.62A2-6.80B2-7.33C2。

响应面分析中对试验结果进行拟合的二次模型方差分析见表10。F值为768.85，R2=0.9986，R2Adj=0.9973，说明模型对实际情况拟合较好；P值为＜0.0001，表明该模型高度显著，可用来进行响应值预测。

表10 中心组合试验模型显著性分析Table 10 The variance of central composite design

利用回归模型对各发酵条件下鲜黄酒感官评价进行预测[32]，为便于观察模型预测结果，将模型预测值与实验值相关图绘于图3，图中可以发现样本点都处于45°对角线附近，说明模型对各发酵条件下低度鲜黄酒预测值与实验值高度相关，两者差别较小。模型预测误差分布图见图4，通常对于一个优良的模型要求大部分样本的预测误差不得超过±2SD。图4中可以看到全部样本点都落在模型的±2SD范围内，没有异常点，说明模型预测准确性高，可以用于对低度鲜酒的发酵工艺进行分析[33]。

图3 模型预测值与实验值相关图Fig.3 Normal plot of residuals on sensory score

图4 残差对模型预测散布图Fig.4 Residuals versus predicted values on sensory score

依据回归方程，利用Design-expert绘出响应面分析图，结果见图5、图6、图7。通过响应面3D图可以明显看到所做试验的范围包括最大值所在区域。

图5 糖度和发酵温度交互作用对感官评价的影响Fig.5 Effects of interactions between brix and fermentation temperature on sensory score

图6 糖度和发酵时间交互作用对感官评价的影响Fig.6 Effects of interactions between brix and fermentation time on sensory score

图7 发酵时间和发酵温度交互作用对感官评价的影响Fig.7 Effects of interactions between fermentation time and temperature on sensory score

利用Design-expert对模型进行分析预测[22]，得到糖度为126 g/L，发酵温度为20.5 ℃，发酵时间为69.2 h，此时的响应值最大且值为96.7分。

2.5 验证性试验

在优化条件下进行验证试验，感官分析的数据为96.6分，试验值与理论预测值非常接近，可见该模型可以较好的预测实际的发酵情况，从而也证明响应面优化低度鲜黄酒发酵工艺的可行性。

3 结论

研究结果表明，利用Design-expert软件进行Plackett-Burman设计、最陡爬坡法与响应面相结合的试验设计方法能快速、有效地从众多影响低度鲜黄酒因素中筛选关键因素，并优化发酵工艺。经上述方法优化后，低度鲜黄酒的最佳发酵工艺为：糖度为126 g/L，发酵温度为20.5 ℃，发酵时间为69.2 h，装液量为195 mL，灭菌时间为2.5 h，接种量为10 mL，此时低度鲜黄酒的感官评价分数最高。鲜酒与发酵后灭菌得到的样品相比较，具有复合果香、无苦涩味且明显更为爽口，因此响应面法能较好地对低度鲜黄酒的发酵条件进行优化，试验可为行业低度鲜黄酒的开发提供数据参考。