云南栘依黄酮提取及其抗氧化、降血糖活性研究

王安娜，彭小伟，阚 欢，王大玮 ，胡 祥，刘 云,

（1.西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224；2.西南林业大学林学院，云南昆明 650224；3.云南省农业科学院热区生态农业研究所，云南元谋 651300）

云南栘依（Docynia delavayi）是一种蔷薇科（Rosaceae）栘依属（Docynia）植物，又称多依[1]，主产于云南、四川、贵州[2]。云南栘依富含黄酮、多酚、多糖等活性物质[3]，具有抗氧化[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、抗肿瘤[7]、抗炎[8]等功效，是一种很好的药食同源性植物。目前对云南栘依的研究主要集中于果实[9]、根茎[10]、叶[11]等，而果实味偏酸涩，一般都被当地人加工制成粗产品。

天然的黄酮类化合物具有抗氧化[12]、降血糖[13]等多种药理作用，已成为国内外开发利用研究的热点，所以云南栘依的研究开发具有较大的发展空间。对于黄酮类化合物来说，不同的提取技术对其得率及品质带来差异[14]。现今，云南栘依黄酮提取方法有李维莉等[15]的超声波辅助、索氏提取法，彭珍华等[16]、李学玲等[17]的超声波辅助乙醇法，而超声波辅助酶法尚未报道，同时对云南栘依黄酮抗氧化、降血糖活性的研究也较少。

为了提高云南栘依的食用及药用价值，对云南栘依进行深入研究是有必要的。本研究采用超声波辅助酶法，通过单因素、响应面试验对云南栘依黄酮提取工艺进行优化，并对云南栘依黄酮进行体外抗氧化、降血糖活性研究，以期为云南栘依黄酮的进一步开发利用提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

栘依果 产自云南省临沧市，于2020年11月采收；芦丁、纤维素酶（50 U/mg）、果胶酶（20 U/mg）、1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、α-淀粉酶（10000 U/g），α-葡萄糖苷酶（700000 U/g） 上海源叶生物科技公司；Na2CO3、NaNO2、Al（NO3）3、Na2HPO4、KH2PO4天津市风船化学试剂科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；BJ-800A粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；ST-3100电子pH计 奥豪斯仪器（常州）有限公司；B25-12DTDS超声波清洗机 宁波新艺超声设备有限公司；DK-98-2恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计 日本岛津公司；SpectraMax-190酶标仪 美谷分子仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 云南栘依预处理 先将云南栘依洗净、切片、去籽，经热风60 ℃干燥，后粉碎过60目筛，密封置4 ℃冰箱，备用。

1.2.2 云南栘依黄酮提取工艺 称取适量样品和复合酶（纤维素酶和果胶酶，用量1%）于离心管中，按料液比加入相应浓度的乙醇溶液，并调整其pH，超声提取一定时间后将样品进行沸水浴5 min（灭酶），真空抽滤，移入100 mL容量瓶，定容。取1 mL样液于25 mL具塞试管中按标准曲线方法在波长510 nm处测定吸光度，并按公式（1）计算云南栘依黄酮得率。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制及云南栘依黄酮含量测定 本实验黄酮测定的方法为亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[18]，于波长510 nm处测定吸光值，得到方程：y=11.9720x+0.0093（R2=0.9996）。按照制作标准曲线的方法处理样品，得到云南栘依中黄酮得率计算公式，公式（1）如下。

式中：V，云南栘依提取液体积，mL；C，样液黄酮浓度，mg/mL；m，云南栘依质量，g；n，稀释倍数。

1.2.4 单因素实验 称取1.00 g云南栘依粉于50 mL离心管中，固定超声功率300 W、提取时间50 min、复合酶（纤维素酶:果胶酶）比例为1:1、液料比30 :1 mL/g、乙醇浓度60%、pH5，改变提取温度（30、40、50、60、70 ℃）、复合酶比例（5:2、4:2、3:2、2:2、2:3、2:4）、提取时间（30、40、50、60、70、80 min）、液料比（15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1 mL/g）、乙醇浓度（45%、50%、55%、60%、65%、70%）、pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）六个因素水平，考察六个因素对超声波辅助酶法提取云南栘依黄酮得率的影响。

1.2.5 响应面试验 在单因素实验基础上，以云南栘依黄酮得率为参考，根据Central Composite Design设计原理。通过单因素实验，从实验方便性及实际成本问题等方面考虑，选取乙醇浓度、酶比例、pH、提取温度作为响应面优化条件进行实验，如表1所示。

表1 响应面试验设计Table 1 Design of response surface test

1.2.6 抗氧化能力的测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率测定 根据章烨雯等[19]的方法，设置样品组、空白组和控制组，均置于37 ℃避光水浴30 min，在波长517 nm测定吸光值；取2.0 mL样品液、DPPH溶液，测得样品组吸光值A；乙醇代替样品液，测得空白组吸光值A0；乙醇代替DPPH溶液，测得控制组吸光值Ax。DPPH自由基清除率计算公式（2）如下：

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率测定 根据Petra等[20]的方法，设置样品组、空白组，室温下避光反应6 min，于波长734 nm处测定吸光值；加0.1 mL样品溶液和3.9 mL ABTS贮备液，测定样品组吸光值A2；用乙醇替代样品液作空白，测定空白组吸光值A1。ABTS+自由基清除率公式（3）如下:

1.2.6.3 羟基自由基清除率测定 根据Bulu等[21]，设置样品组、空白组和控制组，黑暗条件下反应1 h，于510 nm处测定吸光度值；依次加入1.0 mL样品液、1.0 mL H2O2溶液、1.0 mL FeSO4溶液和1.00 mL水杨酸乙醇溶液于不同试管中，测定样品组吸光值As，用乙醇替代样品溶液，测定空白组吸光值Ab；以蒸馏水替代H2O2溶液作为样品控制组，测定吸光度值Ac。羟基自由基清除率公式（4）如下：

1.2.6.4 铁离子还原能力测定 根据沙玉欢等[22]的方法略作修改。依次在试管中分别加入1.0 mL不同浓度样品液、磷酸盐缓冲液和铁氰化钾溶液，摇匀后将试管置于50 ℃水浴锅中反应20 min，取出后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液并摇匀，然后于4000 r·min-1离心10 min，取1.0 mL上清液，分别加入1.0 mL蒸馏水和三氯化铁溶液，于700 nm波长测其吸光值。

1.2.7 云南栘依黄酮降血糖能力的测定

1.2.7.1 黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的影响 根据汤陈鹏[23]和Qin[24]的方法，取100.0 μL样品溶液、α-葡萄糖苷酶（溶解于PBS pH 6.5），在避光条件下反应10 min（37 ℃水浴），然后加入100 μL PGNG，在相同条件下反应20 min，最后加入2.0 mL Na2CO3溶液终止反应，于405 nm处测定样品吸光值AS。同时设空白组和样品控制组，用乙醇代替样品作为空白组AB，用PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液作为控制组AC。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式（5）如下：

1.2.7.2 黄酮对α-淀粉酶活性的影响 根据Zeng[25]的方法，取50.0 μL样品溶液，加入50.0 μLα-淀粉酶溶液溶解于（PBS pH 6.8），在避光条件下反应10 min（37 ℃水浴），加50.0 μL可溶性淀粉在相同条件下反应10 min，加入100.0 μL DNS终止反应，进行沸水浴5 min，后加入1 mL蒸馏水，在540 nm 波长处测定样品吸光值Ai。同时设空白组和样品控制组，用乙醇代替样品作为空白组Am、用等量的PBS代替α-淀粉酶溶液作为控制组Az。α-淀粉酶抑制率计算公式（6）为：

1.3 数据处理

利用软件Design-Expert. 8.0进行实验设计，软件IBM SPASS Statistics 26.0对单因素实验进行显著性分析，软件Graphpad prism 9.0进行IC50值计算，软件Origin 8.0对实验数据（3次平行实验）进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对黄酮得率的影响 由图1可知，黄酮得率在提取温度为50 ℃时达到峰值，为10.34%，黄酮得率先上升后逐渐下降，与陈永平等[26]实验结果一致；50 ℃前，随着温度升高，酶活性增强以及分子运动加快，提取得率随之上升，到50 ℃时黄酮大部分已被提取出；而随着温度继续升高，酶活性降低以及高温可能破坏了其结构[27]，导致黄酮得率下降。因此，选提取温度40、50、60 ℃作为响应面试验优化条件。

图1 提取温度对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

2.1.2 复合酶比例对黄酮得率的影响 由图2可知，随着果胶酶的增加，黄酮得率在复合酶比例3:2达到最高值，为12.49%，黄酮得率为先上升后下降，与刘媛洁等[28]的实验结果相近；黄酮得率变化的原因可能是细胞壁的破坏是以果胶酶和纤维素酶共同作用，在达到适宜的比例时才能够更好地释放出黄酮[29]。因此，本实验选取复合酶比例为4:2、3:2、2:2响应面优化试验条件。

图2 复合酶比例对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of complex enzyme ratio on the yield of flavonoids

2.1.3 提取时间对黄酮得率的影响 由图3可知，得率在时间为50 min达到峰值，为10.41%，黄酮得率随时间增加先上升后下降，与杨宗玲等[30]实验结果一致；其变化的原因大概是随着时间的增加，黄酮逐渐溶出，得率逐渐上升，在50 min时大部分黄酮已溶出，而随着时间延长，溶剂破坏了其结构或是其他醇溶性物质溶出而影响了黄酮得率，导致提取得率下降[31]。为保证实验的可操作性及实验效率，设定提取时间50 min为优化试验的固定参数条件。

图3 提取时间对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

2.1.4 液料比对黄酮得率的影响 由图4可知，黄酮得率在液料比30:1 mL/g时达到最大值，为10.41%，提取得率先升高后下降，与张小梅等[32]实验结果相一致；提取得率的变化可能是源于溶剂的增加，增大了提取液乙醇与提取物长云南栘依黄酮的接触面积，使溶出的黄酮得率增大[33]，在液料比30:1 mL/g时大部分黄酮已溶出，而随之增加进而也逐渐溶出其他物质，使提取得率下降。从实际操作成本及节约资源等方面考虑，选取液料比30:1 mL/g为优化试验的固定参数条件。

图4 液料比对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of liquid-material ratio on the yield of flavonoids

2.1.5 乙醇浓度对黄酮得率的影响 由图5可知，黄酮得率在乙醇浓度为55%时达到峰值，为11.66%。随乙醇浓度增加提取得率先上升而后逐渐下降，可能是由于随着乙醇浓度增加，云南栘依内外极性差异的增加，提取得率渐渐升高，在乙醇浓度为55%时极性相近提取得率达到最大，而浓度继续增加，极性差异太大不利于溶出[34]，使黄酮得率逐渐变低。因此，选取乙醇浓度水平为50%、55%、60%作响应面试验优化条件。

图5 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.1.6 不同pH对黄酮得率的影响 由图6可知，黄酮得率在pH4.5时达到峰值，此时提取得率为11.17%，黄酮得率先向上后缓慢向下，与刘媛洁等[28]的研究结果相似；提取得率下降大概是因为复合酶最适的环境为pH4.5，而当pH逐渐升高，酶的活性受到影响而减弱，从而降低了黄酮得率[35]。因此，选取pH4.0、4.5、5.0作为响应面优化试验条件。

图6 pH对黄酮得率的影响Fig.6 Effect of pH on the yield of flavonoids

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面结果与方差分析 通过试验，得出以乙醇浓度（A）、复合酶比例（B）、pH（C）、提取温度（D）四个因素间交互作用对云南栘依黄酮得率的影响，并以提取得率为响应值。如表2所示，进行二次多项式回归分析的方程为：

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface test

黄酮得率（%）=13.01+0.17A+0.23B+0.29C+0.29D+0.26CD-0.82A2-1.02B2-0.91C2-1.06D2

根据响应面设计方案，进行方差分析，见表3。对回归模型进行了显著性检验，如表3所示，得出回归模型显著（P＜0.001），失拟项为不显著（P=0.1001），说明该模型可用；R2=0.9864（R2Adj=0.9737）则说明该响应面试验可以运用实际操作。由表3可知：A、CD（P＜0.01）对试验结果影响较显著，B、C、D、A2、B2、C2、D2（P＜0.001）则为极显著水平。由F值知，云南栘依黄酮得率被各因素影响的程度为pH=提取温度＞复合酶比例＞乙醇浓度。

2.2.2 各因素交互作用 由表3的方差分析表可知，其AB、AC、AD、BC、BD对响应值的影响未见显著（P＞0.05），CD交互作用对响应值的影响显著（P＜0.01）。如图7所示，3D图的表面斜率越陡，两个因子之间的相互作用越大；等高线轮廓椭圆度的相互作用的显著性反映，趋于椭圆形反映出交互作用的显著性[36]，这就说明pH与温度间的交互作用对云南栘依黄酮得率的影响程度较大，这与表3显著性检验结果是一致的。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

图7 pH与温度交互作用对黄酮得率的影响Fig.7 Interaction of pH and temperature on the yield of flavonoids

2.2.3 模型的验证实验 经响应面模型分析得到云南栘依黄酮优化提取条件为：乙醇浓度55.55%，复合酶比例3.1:2，提取温度51.68 ℃，pH4.59，此时预测黄酮得率为13.01%。为了实际操作将参数做出调整：乙醇浓度55%、复合酶比例3:2、提取温度50 ℃，pH4.5；进行三次平行实验，得到黄酮得率为13.10%，与模型预测值相差0.09%，说明该模型实验可重复性好，可信度高，能较好预测云南栘依黄酮得率。

2.3 云南栘依黄酮的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由图8可知，云南栘依黄酮和VC随着浓度增加对DPPH自由基清除率升高后逐步趋于平稳；黄酮浓度在一定的范围内（0.03～0.12 mg/mL），DPPH自由基清除能力对黄酮浓度呈依赖性增长，当超过0.12 mg/mL趋于平衡状态，当黄酮浓度到0.14 mg/mL时，对DPPH自由基清除率接近VC，达93.20%，与陈永平等[26]实验中总黄酮清除DPPH自由基的浓度依赖性趋势一致；云南栘依黄酮和VC对DPPH自由基清除率IC50值为0.04、0.01 mg/mL，大于黄丽萍等[5]研究得出的栘依皮的乙醇提取物对DPPH自由基清除率的IC50值（0.1475 mg/mL），说明云南栘依黄酮对DPPH自由基有较好的清除能力。

图8 云南栘依黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of D. delavayi flavonoids and VC on DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 由图9可知，云南栘依黄酮和VC随着浓度增加对ABTS+自由基清除率逐渐升高后趋于稳定，黄酮浓度（0.20～1.40 mg/mL）与ABTS+自由基清除率之间存在着量效关系。云南栘依黄酮和VC两者对ABTS+自由基清除率IC50值分别为0.29、0.18 mg/mL，与章烨雯等[19]实验中总黄酮对ABTS+自由基清除率IC50值相接近，并且当黄酮浓度到1.2 mg/mL时，对ABTS+自由基清除率接近VC，达96.4%，说明云南栘依黄酮对ABTS+自由基有较强的清除能力。

图9 云南栘依黄酮和VC对ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of D. delavayi flavonoids and VC on ABTS+ free radical

2.3.3 羟基自由基清除能力 由图10可知，云南栘依黄酮和VC随浓度升高对羟基自由基清除率增强后趋于稳定，两者对羟基自由基清除率IC50值分别为0.70、0.15 mg/mL，云南栘依黄酮对其清除能力略低于VC，大于黄丽萍等[5]研究的栘依皮乙醇提取物对羟基自由基清除率IC50值（61.11 mg/mL）。李学玲等[17]通过研究云南大果栘依黄酮对羟基自由基清除能力，发现当浓度为7.94 mg/L时，清除率最大，达83.20%；而云南栘依黄酮在2.5 mg/mL时，已经与其实验结果相接近，达83.15%，说明云南栘依黄酮对羟基自由基有较好的清除能力。

图10 云南栘依黄酮和VC对羟基自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effect of D. delavayi flavonoids and VC on hydroxyl free radical

2.3.4 铁离子还原能力 云南栘依黄酮和VC的铁离子还原能力，吸光度大小反映了还原能力的强弱[30]，由图11可知，在浓度0.20～1.00 mg/mL范围内，云南栘依黄酮和VC的还原能力有良好的线性关系，而当浓度大于1.00 mg/mL，还原能力趋近平衡，呈一定浓度的正相关性，说明云南栘依黄酮具有较好的铁离子还原能力。

图11 云南栘依黄酮和VC对铁离子还原能力Fig.11 Reducing effect of D. delavayi flavonoids and VC on iron ions

2.4 云南栘依黄酮的降血糖能力

2.4.1α-葡萄糖苷酶抑制活性 由图12可知，在浓度0.03～8.00 mg/mL范围内，云南栘依黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制率随浓度升高而上升（23.61%～76.97%），存在着剂量依赖性；当浓度大于8.00 mg/mL后，对α-葡萄糖苷酶的抑制率趋近于平衡状态。云南栘依黄酮抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值（0.86 mg/mL）大于阿卡波糖（0.08 mg/mL），但小于黄秋葵黄酮（3.87 mg/mL）[37]，说明云南栘依黄酮对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制能力，是可以进一步开发利用的天然储备药物。

图12 云南栘依黄酮和阿卡波糖对α-葡糖糖苷酶抑制能力Fig.12 Inhibitory effect of D. delavayi flavonoids and acarbose on α-glucosidase

2.4.2α-淀粉酶活性抑制活性 由图13可知，在浓度0.05～3.00 mg/mL范围内，云南栘依黄酮对α-淀粉酶活性的抑制能力呈浓度依赖性增长（28.56%～82.72%），当浓度大于3.00 mg/mL后，对α-淀粉酶的抑制率趋近于平衡状态。云南栘依黄酮、阿卡波糖抑制α-淀粉酶的IC50值分别为0.37、0.05 mg/mL，云南栘依黄酮对α-淀粉酶的抑制能力低于阿卡波糖，在浓度为1.00 mg/mL时，与牡丹花黄酮对α-淀粉酶的抑制能力相近[32]，说明云南栘依黄酮对α-淀粉酶有较好的抑制率。

图13 云南栘依黄酮和阿卡波糖对α-淀粉酶抑制能力Fig.13 Inhibitory effect of D. delavayi flavonoids and acarbose on α- amylase

3 讨论与结论

栘依为植物性果实，细胞壁由纤维素、果胶质等组成[30]，加入适宜的纤维素酶及果胶酶有助于其黄酮类物质的溶剂提取，本实验采用超声波辅助酶法，考察提取温度、复合酶比例、提取时间、料液比、乙醇浓度、pH六个因素对云南栘依黄酮得率的影响，并通过响应面法优化提取工艺参数。结果发现超声波辅助酶法有明显的优势，与彭珍华[16]、李维莉等[15]、李学玲等[17]相比分别提高了8.86倍、1.30倍、3.18倍，说明本方法提取效率相对较高，可为加快云南栘依的开发与利用提供一种高效、节能、安全的提取黄酮的工艺参考。许多抗氧化、降血糖研究证明，黄酮类等化合物是主要的抗氧化[26-30]、降血糖[23-25]物质，其浓度与能力呈良好的量效关系；本文与之相符，黄酮浓度与抗氧化、降血糖能力，在一定的范围内存在着剂量依赖性。黄丽萍等[5]研究发现栘依皮提取液具有较好的抗氧化、降糖及降脂能力，而本实验进一步证实了云南栘依黄酮在抗氧化、降血糖能力上有一定的作用。

本文采用超声波辅助酶法提取云南栘依黄酮的最佳工艺参数为提取温度50 ℃、复合酶比例3:2、提取时间50 min、液料比30 mL/g、乙醇浓度55%、pH4.5，黄酮得率达到了13.10%，与预测值13.01%接近，模型可靠。体外抗氧化活性研究表明云南栘依黄酮对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基清除能力的IC50分别为0.04、0.29、0.70 mg/mL，同时对铁离子还原有一定的能力；体外降血糖研究表明云南栘依黄酮抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的IC50分别为0.86、0.37 mg/mL，证明了云南栘依黄酮具有较好的抗氧化、降血糖能力。因此，云南栘依黄酮可作为一种具有很大潜力的抗氧化和降血糖的药用野生资源，其成本小、资源丰富，值得进一步开发利用。本研究为云南栘依黄酮的进一步研究提供实验依据，但本文对云南栘依黄酮提取得到的只是粗黄酮，存在着多种杂质，有待进一步纯化分离，进而对其更深一步体内抗氧化、降血糖进行研究。