黑莓、树莓不同发育时期叶片鞣花酸与抗氧化、糖类物质的相关性分析

王佳鸾，赵俸艺，吴文龙，张春红, ，李维林,2

（1.江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014；2.南京林业大学，江苏南京 210037）

植物界蕴含着丰富的营养物质，为营养物质的天然储藏库。植物中抗氧化途径主要分为酶途径与非酶途径两种。非酶途径主要为抗氧化物质、维生素等，而摄入人体抗氧化活性较高的为非酶途径的抗氧化物质。黑莓（Blackberry）与树莓（Raspberry）同为蔷薇科悬钩子属（RubusL.）多年生果树，果实为聚果型小浆果。黑莓原产于北美[1]，最先由江苏省中国科学院植物研究所在1986年引入国内[2]。树莓含有多种营养成分与微量元素，含有多种有益于人体健康的活性物质[3]。黑莓具有优秀的抗氧化活性而被称为抗氧化之王，酚酸类物质为植物体内重要的次生代谢产物，鞣花酸为酚酸类物质之一，为果实中重要的抗氧化活性物质之一。

鞣花酸为没食子酸二聚体[4]，是一种天然的多酚二内酯[5]，其广泛存在于多种植物体内[6-9]。鞣花酸具有多种生物活性如：抗氧化活性[10-11]、抗癌活性[12-15]、缓解糖尿病[16-17]、抗炎活性[18-20]以及保健功效[21-23]等，对保持人体健康具有一定的辅助作用。由于鞣花酸同时具有亲水与亲脂结构这种特殊的理化性质，导致鞣花酸在多种溶剂中溶解度较差[24]，导致鞣花酸在工业生产以及日常生活中使用较少。总酚为酚类物质的总称，除抗氧化活性外还具有抗癌[25]、抗炎[26]、抑菌[27]等活性。类黄酮物质在植物体内为重要的次生代谢产物，黄酮为膳食中含量最为丰富的酚酸类物质[28]，对植物的生长发育与抵御逆境胁迫均发挥重要作用。维生素C为水溶性维生素，其具有很强的还原性[29]，同时也具有一定的抗癌活性[30]。氧化是衰老和部分疾病产生的重要影响因素之一[31-33]，这使得机体抗氧化尤为重要，而抗氧化物质的摄入对此大有裨益。糖类物质为主要的生理指标，鞣花酸合成途径为莽草酸途径，鞣花酸可以与糖类物质结合成糖苷，糖类物质的含量对游离鞣花酸含量具有一定影响。

目前对黑莓、树莓的研究主要集中在果实，包括果实品质、果实贮藏等[34-35]，而目前对叶片中鞣花酸含量的研究报道较少。鞣花酸广泛存在于多种植物体内，且在植物的不同部位均有所分布，但其在植物体内的不同部位含量与分布均有所不同。目前有文献报道鞣花酸含量种子＜果汁＜果皮＜叶片[36]。叶片作为种植业中的副产品，较果实更为便宜、量大且更易获得，具有一定的潜在经济利用价值。本文对不同品种黑莓、树莓不同生长时期叶片中鞣花酸含量进行测定，并对不同发育时期抗氧化物质以及糖类物质含量进行测定，旨在初步揭示叶片中鞣花酸含量与抗氧化特性的变化趋势及关系，对悬钩子属小浆果叶片的潜在利用价值进行综合分析，以期为后续叶片开发利用、鞣花酸的深入研究以及抗氧化产品的研发提供部分理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑莓、树莓不同发育时期叶片 主要为江苏省主要种植品种以及自主繁育的优良品种，均采自江苏省中国科学院植物研究所溧水科学基地，选取正常生长无病虫害的完整叶片，擦干表面水分-30 ℃保存待用。叶片按其生长发育时期分为：嫩叶期（从顶端起1～3片）、伸展叶期（从顶端起3～8片，完全伸展生长的功能叶片）以及老叶期三个时期；鞣花酸标准品（含量＞96%） 叶源生物公司；NaOH 分析纯，西陇科学；乙醇 分析纯，华大公司；DPPH自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力测定试剂盒、维生素C测定试剂盒、类黄酮试剂盒、可溶性糖试剂盒、蔗糖测试盒、葡萄糖试剂盒、果糖试剂盒 南京建成生物有限公司。

Centrifuge 5804 R低温高速离心机 德国Eppondorf；759-紫外分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；Multiskan Sky酶标仪 德国Thermo Scientific；FA1004电子天平 舜宇公司；HH-2数显恒温水浴锅 常州润华电器有限公司；KQ-300DE超声清洗仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鞣花酸提取与含量测定 鞣花酸提取方法主要为溶剂提取法，一般采用超声波辅助[37]、酸辅助水解[38]以提高提取率。参照文献[39]方法，本实验采用超声辅助溶剂提取法。取冷冻保存叶片1 g，剪碎液氮研磨成粉末，准确秤取0.100 g叶片粉末，加入2 mL 40%乙醇作为提取溶剂，80 ℃超声提取20 min，超声提取后7000 r/min离心10 min，取其澄清上清液待测。

鞣花酸含有酯基和酚羟基，容易与碱发生反应[24]，采用紫外分光光度法能够快速检测鞣花酸含量。根据陈笳鸿等[40]的方法，在待测液中加入0.1 mol/L NaOH，其可与鞣花酸发生反应并且在357 nm处有最大吸收峰，该方法根据统计学分析可信度为95%，误差较小，可用于鞣花酸的快速检测。1.2.1中获得的待测上清液与稀碱按1:4（v:v）混匀后室温反应15 min，用蒸馏水调零，测定吸光度值，通过标准曲线y=0.0504x+0.003（R2=0.999）计算待测样品中鞣花酸含量。

1.2.2 抗氧化物质与糖类物质含量测定 取冷冻保存的叶片，液氮研磨成粉。配制0.1 mol/L pH7.4的PBS作为缓冲液，按照料液比为1:9（g:mL）涡旋混匀，7000 r/min离心5 min取上清液。采用试剂盒比色法测定不用发育时期叶片中总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，黄酮、维生素C、可溶性糖、果糖、葡萄糖、蔗糖等含量。

叶片总酚含量测定采用Floin-Ciocalteu法[41]，将研磨的叶片粉末按照料液比为1:20加入50%乙醇，35 ℃超声提取20 min，离心7000 r/min离心5 min除杂，取1 mL上清液加入0.5 mL福林酚试剂、2 mL 7.5%碳酸钠溶液和6.5 mL蒸馏水，涡旋混匀，静置2 h后，750 nm处测定吸光度值，通过标准曲线y=0.128x+0.00045（R2=0.999）计算样品中总酚含量。

1.3 数据处理

采用SPSS17.0对实验数据进行分析，采用Excel 2013进行数据统计和绘图分析。

2 结果与分析

2.1 树莓、黑莓叶片中鞣花酸含量

对溧水实验基地中黑莓、树莓、黑莓树莓杂交种，共21个品种叶片的三个生长时期中鞣花酸含量进行测定后发现，鞣花酸含量随叶片的生长发育呈下降趋势，其中嫩叶中鞣花酸含量最高。‘宝森’不同生长时期的叶片中鞣花酸含量均较高，‘宝森’嫩叶中鞣花酸含量最高为39.622 mg/g FW。红树莓‘哈瑞泰兹’伸展叶中鞣花酸含量高于嫩叶中含量为28.066 mg/g FW。‘赫尔’、‘纳瓦荷’与红树莓品种中嫩叶与伸展叶中鞣花酸含量相近，而‘赫尔’与‘纳瓦荷’老叶中鞣花酸含量有所降低，‘哈瑞泰兹’老叶中的鞣花酸含量最低约为7.649 mg/g FW，其下降趋势较为明显，详细结果见表1。

表1 不同品种黑莓、树莓叶片不同生长时期鞣花酸含量Table 1 Ellagic acid content in leaves of different varieties of blackberry and raspberry at different growth stages

2.2 抗氧化物质含量分析

本文从21个品种中选取鞣花酸含量较高、较低以及不同发育期内鞣花酸含量变化较大的品种进行后续实验分析。选取‘宝森’、‘卡依娃’、‘宁植2号’、红树莓‘哈瑞泰兹’、‘纳瓦荷’等品种对其进行抗氧化指标分析，对叶片的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，总酚、类黄酮、维生素C等含量变化进行测定，旨在进一步评价悬钩子属小浆果叶片的潜在利用价值。测定叶片中除红树莓‘哈瑞泰兹’外，DPPH自由基清除能力变化规律与总抗氧化能力相似均随叶片的生长发育呈现下降的趋势，均以嫩叶中含量高，结果详见图1。其中‘宝森’、‘卡依娃’、‘宁植2号’叶片中抗氧化能力与DPPH自由基清除能力均为嫩叶最高老叶中最低而‘纳瓦荷’品种中为伸展叶中最低。红树莓‘哈瑞泰兹’为伸展叶中总抗氧化能力与DPPH自由基清除能力均较嫩叶中高，分别约为331.738 U/mg prot FW和1121.784 mg Trolox/g FW。‘纳瓦荷’的伸展叶中抗氧化能力与DPPH自由基清除能力均较其他发育时期低，分别为92.600 U/mg prot FW和420.691 mg Trolox/g FW。

图1 黑莓叶片抗氧化能力测定Fig.1 Determination of antioxidant capacity of blackberry leaves

黑莓、树莓叶片中抗氧化物质含量测定如图2所示，叶片中总酚含量均表现为随叶片发育生长呈下降趋势，嫩叶中最高，老叶中含量最低。‘宝森’嫩叶中总酚含量最高为161.306 mg/g FW，‘哈瑞泰兹’老叶中总酚含量最低为78.361 mg/g FW。类黄酮为酚酸类物质为重要的次生代谢产物，为膳食摄取的主要酚酸类物质之一，其含量变化与总抗氧化能力变化趋势相似。‘宝森’、‘卡依娃’、‘宁植2号’黄酮含量随叶片生长而逐渐降低，其中‘卡依娃’嫩叶中类黄酮含量最高为22.557 mg/g FW。红树莓‘哈瑞泰兹’伸展叶中类黄酮含量相较其余两个发育时期高，为11.391 mg/g FW。‘纳瓦荷’伸展叶与老叶中类黄酮含量接近，分别为9.023和9.648 mg/g FW。维生素C为水溶性抗氧化物质，‘宝森’品种叶片中维生素C含量总体较高，其嫩叶中最高为193.533 mg/g FW。综合测定结果表明‘宝森’、‘卡依娃’品种嫩叶以及‘哈瑞泰兹’伸展叶的抗氧化能力与抗氧化物质含量较高，抗氧化能力较强。

图2 黑莓叶片抗氧化物质含量测定Fig.2 Content determination of antioxidant substances in blackberry leaves

2.3 糖类物质含量分析

糖类物质为重要的能源物质，参与众多代谢活动，为测定的重要生理指标之一。黑莓、树莓叶片中鞣花酸含量随叶片的生长发育整体为下降趋势。据报道，鞣花酸合成通路为莽草酸途径，鞣花酸合成始于4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸的缩合，而磷酸烯醇式丙酮酸可参与糖类物质的合成代谢[42]，同时鞣花酸可以与糖结合形成糖苷，虽糖苷也具有丰富的生物活性[43]，但糖类物质对游离鞣花酸含量具有一定影响。本文采用试剂盒法对黑莓不同发育时期叶片中可溶性糖、果糖、葡萄糖、蔗糖等含量进行测定。结果如图3所示，发现叶片中糖类物质含量随叶片的生长发育呈现上升的趋势，嫩叶中糖类物质含量普遍较低，老叶和伸展叶中含量较高。测定发现叶片中可溶性糖含量整体呈上升趋势，‘宝森’老叶中可溶性糖含量最高为19.395 mg/g FW，而‘卡依娃’嫩叶中含量最低为7.834 mg/g FW。黑莓叶片中蔗糖含量为嫩叶中最低，其中‘宁植2号’嫩叶中含量最低为0.813 mg/g FW，而其伸展叶中蔗糖含量最高为2.841 mg/g FW。果糖与葡萄糖含量除红树莓外总体为上升趋势，‘哈瑞泰兹’中伸展叶中果糖与葡萄糖含量均较低分别为4.591和3.923 mg/g FW。‘哈瑞泰兹’老叶中果糖含量最高为5.957 mg/g FW，‘纳瓦荷’老叶中葡萄糖较高为9.016 mg/g FW。

图3 黑莓、树莓叶片糖类物质含量测定Fig.3 Determination of carbohydrate content in blackberry and raspberry leaves

2.4 叶片发育进程鞣花酸与其他抗氧化、糖类指标相关性分析

对本文黑莓、树莓共五个品种叶片发育进程中鞣花酸含量与其他指标含量相关性进行相关性分析（表2），随叶片的生长发育鞣花酸含量逐渐下降其嫩叶中含量最高，而在此生长发育过程中鞣花酸与其他测定的抗氧化物质总体呈现正相关且变化趋势相同，其中鞣花酸与总酚含量在极显著水平上呈现正相关。由于维生素C在叶片中变化趋势为先下降后上升，在‘卡依娃’、‘纳瓦荷’、‘宁植2号’品种中与鞣花酸含量呈现负相关。糖类物质在叶片中变化趋势为上升趋势，在嫩叶中含量最低，但在部分品种中伸展叶中糖类物质含量较高，可能是由于伸展叶功能活性较强导致。鞣花酸与糖类物质含量总体呈现负相关，且部分指标在显著的水平上呈现负相关。

表2 黑莓、树莓叶片发育进程中各品质指标与鞣花酸含量的相关性分析Table 2 Correlation analysis between ellagic acid content and quality indexes during leaf development of blackberry and raspberry

2.5 不同物种叶片鞣花酸含量分析

鞣花酸为酚酸类物质之一，为重要的次生代谢产物，引起具有多种优秀的生物性而被广泛研究。对其他不同物种叶片中鞣花酸含量进行统计如下表3，石榴叶片中鞣花酸含量较低，因生长环境以及品种的不同，鞣花酸含量也有所差异。常见园艺果实草莓中其干叶片中鞣花酸含量较高且最高可到32.300 mg/g。树莓‘秋福’与石榴‘泰山红’叶片中鞣花酸含量较低分别为0.519与0.622 mg/g。

表3 不同物种叶片中鞣花酸含量Table 3 Ellagic acid content in leaves of different species

3 讨论与结论

随着社会的发展与进步，人们愈来愈关注自身健康，食补也备受重视。黑莓、树莓因其果实具有丰富的营养物质而被广泛关注，有研究表明经常食用富含酚酸类物质的食物对慢性疾病的发生具有积极的影响[47-48]，所以发现膳食生活中鞣花酸以及酚酸类物质含量较高的食品，对保持人体健康具有深远的意义。唐莹等[49]将树莓叶片炮制成叶片茶后，经检测其茶香滋味鲜醇且具有良好的抗氧化以及抑菌效果，而叶片为生产加工中的副产品，其较于果实更易获得且价格低廉，可作为鞣花酸提取研究样品，对黑莓、树莓鞣花酸以及酚酸类物质的研究具有一定的意义，同时嫩叶可以开发成叶片茶具有一定的潜在经济利用价值。

综上所述，相较于前人研究，本文测定品种叶片中鞣花酸含量相对较高，在测定的21个品种中‘宝森’和‘卡依娃’品种叶片中鞣花酸含量较高且嫩叶中含量最高为39.622 mg/g FW，显著高于表格中测定品种，但由于测定方法以及叶片发育时期的不同，鞣花酸含量也存在一定差异，但可以肯定的是黑莓嫩叶中鞣花酸含量丰富，具有一定的研究以及经济利用价值。在对总抗氧化活性，自由基清除能力、以及抗氧化物质含量测定中‘宝森’和‘卡依娃’品种均含量较高，其中‘卡依娃’品种中黄酮含量最高为22.557 mg/g FW，‘哈瑞泰兹’叶片中鞣花酸含量为伸展叶最高，除黄酮含量外其余抗氧化指标均为伸展叶中较高。在糖类物质的测定中，糖类物质与鞣花酸等抗氧化物质呈负相关，均为嫩叶中最低，这主要是因为糖类物质的合成、鞣花酸和其他酚酸类物质合成、黄酮类物质的合成均与磷酸烯醇式丙酮酸相关，磷酸烯醇式丙酮酸在酶的作用下生成丙二酰CoA，为黄酮类物质合成的起始物质，磷酸烯醇式丙酮酸为鞣花酸合成起始物质之一，同时也参与糖类物质的代谢与合成。近年来，对悬钩子果实中鞣花酸合成通路以及中间代谢产物均有研究[42]，但对叶片中鞣花酸累积规律鲜有报道，鞣花酸在植物体内不同部位含量分布不同，叶片中鞣花酸含量较高且具有一定开发利用价值，本文旨在为后续黑莓、树莓叶片的深入研究与开发利用提供部分理论基础。