QuEChERS结合GC-MS/MS测定辛辣蔬菜中18种有机磷农药

陈 华

(宁德市农产品质量安全检验检测中心， 福建 宁德 352100)

有机磷农药(organophosphorus pesticide，OPPs)指一类含磷元素的有机酯类化合物，因其具有高效、广谱、降解快、价格低等优势，广泛运用于农业生产中的病虫害防治[1]。OPPs的作用机理主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，引发乙酰胆碱过度积累，进而干扰害虫的神经传导[2]。然而，使用不当的OPPs可通过食物链进入人体，扰乱人体的认知能力及神经行为，导致机体出现震颤、出汗、畸形、内分泌失调等中毒症状，重者可因呼吸麻痹而死亡[3-4]。虽然我国已明令禁止在果蔬上使用多种有机磷农药，并在食品安全国家标准GB 2763-2021《食品各农药最大残留限量》中设置了最大残留限量(maximum residue limit，MRL)以限制农药使用[5]，但在实际检测中依然能检出有机磷农药超标[6-7]。

当前，对蔬菜中农药残留检测的方法主要有气相色谱法(Gas chromatography，GC)、气相色谱-质谱法(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)、气相色谱-串联质谱法(Gas Chromatography-Mass SpectrometryGC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等[8]。QuEChERS法是近年兴起的一种样品前处理方法，具有快速、简单、节约、安全等特点，广泛用于果蔬中的农药残留检测[9]。辛辣蔬菜作为一类特殊蔬菜，深受广大人群的喜爱，同时占据着较大的市场份额[10]，但在农残检测领域，尚未见对辛辣蔬菜有机磷农药检测进行系统的分析研究。本研究采用QuEChERS前处理技术，以常见的7种辛辣蔬菜为研究对象，结合GC-MS/MS法探究在不同辛辣蔬菜中快速筛查有机磷农药残留情况，以期为辛辣蔬菜的农药检测提供借鉴经验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

香葱、大蒜、洋葱、生姜、韭菜、青椒和红椒，样品购于生鲜超市及农贸市场，经检测不含试验所研究农药。

1.2 仪器与试剂

1.2.1仪器 岛津GCMS-TQ8040型气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(日本岛津制作所)；Aglient DB-5 MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)色谱柱(美国Aglient 公司)；VORTEX-5型涡旋振荡器(海门其林贝尔公司)；Sigma 3-18KS 型高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；PL602E电子天平(瑞士METTLER公司)；Organomation EVAP-111氮吹仪(美国Organomation公司)。

1.2.2试剂 18种有机磷农药标准样品(辛硫磷、灭线磷、甲拌磷、特丁硫磷、二嗪磷、氯唑磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、甲拌磷亚砜、马拉硫磷、甲拌磷砜、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、甲基异柳磷、丙溴磷、三唑磷、伏杀硫磷)购于农业部环境保护科研监测所，质量浓度100 mg·L-1；乙腈、丙酮、正己烷均为色谱纯，购于上海安谱公司；氯化钠、PSA(40～63 μm)、GCB(120～400目)购于上海安谱公司。

1.3 试验方法

1.3.1样品前处理 准确称取10.0 g样品经料理机充分搅碎后装于50 mL离心管，加入20.0 mL的乙腈、5.0 g NaCl、1.0 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，充分震荡混匀后超声提取15 min，5 000 r·min-1离心3 min。离心后吸取8.0 mL上清液加入N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)100 mg、石墨化碳黑(Graphitized carbon black，GCB)10 mg、MgSO4 700 mg。涡旋振荡1 min后5 000 r·min-1离心3 min，吸取1.0 mL上清液于10.0 mL试管，40℃氮吹至近干，加入1.0 mL丙酮与正己烷(1+1，V∶V)混合液复溶，过0. 22 μm滤膜后待 GC-MS/MS 测定。

1.3.2配制农药标准溶液 分别取 0.4 mL的100 mg·L-1的有机磷农药标准储备液于 10 mL 容量瓶中，得到4 mg·L-1的中间储备液。分别使用7种蔬菜的空白基质液配制为50、100、200、500、1 000、2 000 μg·L-1的系列标准曲线工作液，采用空白基质加标的方式，依据峰面积y对质量浓度x进行线性回归，绘制标准曲线，得到线性回归方程、相关系数，以信噪比≥10 计算定量限(Limit of Quantitation，LOQ)。

1.3.3色谱条件 进样量：1 μL；载气：氦气；程序升温条件：初温50℃，保持1 min，以25℃·min-1升温至125℃，再以10℃·min-1升温至280℃。

1.3.4质谱条件优化 离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂延迟时间：3.0 min。采用全扫描方式寻找目标化合物中具有最强检测讯号的离子碎片，采集具有最佳丰度的2～3个离子碎片，再进行产物离子扫描以确定最佳子离子。进一步使用岛津GC-MS/MS library软件自动优化各化合物的碰撞能(collision energy，CE)，得到多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式下各农药化合物的目标离子、参考离子及最佳作用电压。

1.3.5提取剂的选择 根据待测农药特性和提取溶剂化学性质考虑，以确定选用提取溶剂的原则。本研究涉及的样品为辛辣蔬菜，其多含有较多水分，且有机磷杀菌剂多易溶于丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂，故分别使用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂。

1.3.6净化剂的选择 使用PSA、GCB作为主要净化剂，设置2因素3水平试验，每组进行3次平行试验，统计各试验组农药项目的平均回收率。

1.3.7基质效应评价 基质效应(matrix effects，ME)评价方式采用基质匹配标准曲线的斜率与纯溶剂配制标准曲线的斜率的比值来定量评价。通过以下公式计算ME：

式中：Sm和Ss分别为基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。当ME<0时表示基质抑制效应；当ME>0时，表示基质增强效应。当|ME|≤20 %为弱基质效应，20 %<|ME|≤50%为中等基质效应，|ME|>50%为强基质效应[11-12]。本研究采用0. 10 mg·L-1基质标准溶液和同等浓度的丙酮与正己烷(1+1，V∶V)混合液的峰面积进行比较，从而确定样品基质效应的强弱。

1.3.8回收率和重复性测定 在阴性香葱、大蒜、洋葱、生姜、韭菜、青椒和红椒样品中，在 0.05、0.10 和 0.50 mg· kg-13个添加水平进行加标试验，单水平设置6次重复并计算回收率和重复性。

1.3.9实际样品检测 在市售蔬菜中抽取21批次样品，涵盖香葱、大蒜、洋葱、生姜、韭菜、青椒和红椒7种样品，依据“1.3.1”方法处理后上机检测。

1.4 数据处理

使用EXCEL进行数据处理及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

由图1可知，采用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂进行样品提取时，18种有机磷农药的平均回收率分别为87.14%、67.76%、90.77%、86.48%，以乙腈作为提取剂时18种农药回收率最高，故采用乙腈作为农药提取溶剂。

图1 不同溶剂条件下18种有机磷农药的回收率(n=3)Fig.1 Recoveries of 18 kinds of organophosphorus pesticides under different solvent conditions (n=3)

2.2 净化方法的优化

QuEChERS试验中常用的分散剂有PSA、GCB和C18等，其中PSA 可用于去除碳水化合物、脂肪酸、酚类和少量色素，GCB主要用于去除色素、甾醇类和非极性干扰物，而C18 主要用于去除脂肪和酯类等非极性物质。鉴于目标样品中油脂含量较低，故本研究主要选用PSA、GCB对溶剂进行净化。由表1可知，各试验组合回收率范围介于83.40～93.42%，4号试验组具有最高的回收率，据此可以确定PSA的最佳用量为100 mg，GCB的最佳用量为10 mg。

表1 分散剂中各组分含量Table 1 Content of each component in the dispersant

2.3 质谱条件的选择

经优化后得到MRM模式下各农药化合物的目标离子、参考离子及最佳作用电压，各农药化合物质谱参数见表2。配制浓度为100 μg·L-1的农药标准品进样分析，获得农药混标的总离子流(total ion current，TIC)图谱，可知多种有机磷农药经色谱柱得到初步分离，并达到较好的分离效果，见图2。

注：A为辛硫磷；B为灭线磷；C为甲拌磷；D为特丁硫磷；E为二嗪磷；F为氯唑磷；G为甲基对硫磷；H为杀螟硫磷；I为马拉硫磷；J为甲拌磷砜；K为毒死蜱；L为甲拌磷亚砜；M为对硫磷；N为水胺硫磷；O为甲基异柳磷；P为丙溴磷；Q为三唑磷；R为伏杀硫磷图2 GC-MS/MS中18种农药标准溶液TIC谱图Fig.2 TIC chromatogram of the standard solutions of 18 kinds of organophosphorus pesticides by GC-MS/MS

表2 18种有机磷农药质谱信息Table 2 Mass spectrometry information of 18 kinds of organophosphorus pesticides

2.4 基质效应的评价

通过与纯溶剂标准品比较，发现相同浓度的基质液的农药出峰面积大于在溶剂中的出峰面积， |ME|值介于5.23～228.49%，主要表现为基质增强效应。为保证定量结果准确，本研究采用基质匹配标准曲线来准确定量。

2.5 方法的回归方程、相关系数和定量限

经考察其线性相关系数(r2)均大于 0.99，表明在其质量浓度范围内7种农药的线性关系均良好，能较好地克服样品提取、净化及上机测定过程造成的误差。以辣椒为代表基质，使用辣椒空白样品作为基质添加浓度为100 μg·L-1的农药标准品后按“1.3.1”方法进行试验操作，以信噪比≥10计算LOQ，经过计算该法的LOQ介于0.004～0.009 mg·kg-1，低于国家标准GB 23200.113-2018《植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱 质谱联用法》[13]LOQ的限值，能满足日常检测的需求。

2.6 方法的回收率和重复性

由表3可知，在添加水平为0.05 mg·kg-1时，各供试样品对不同农药项目的回收率介于60%～120%，在添加水平为0.10、0.50 mg·kg-1时，各供试样品对不同农药的回收率介于80%～110%，检测结果相对标准偏差RSD(%)均小于5，表明本研究建立方法得到的数据稳定可靠。

表3 18种农药在7种辛辣蔬菜中的回收率(n=6)Table 3 Recoveries of 18 kinds of pesticide residues at 7 kinds of pungent vegetables (n=6)

续表3

2.7 实际样品检测

对抽检的21批次样品进行检测，在1份生姜检出毒死蜱，浓度为0.018 mg·kg-1，其检出值皆在其线性浓度范围之内，根据GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》国家标准，含量低于MRL。

3 讨论和结论

乙酸乙酯、甲醇、丙酮和乙腈均为农残分析常用的提取溶剂，乙酸乙酯易于提取蜡质、脂肪等非极性提取物，但其不溶于水，对水中溶解度稍大的目标物回收率较低；甲醇的极性最强，但对部分农药的提取率却不如乙腈；丙酮易于提取样品中的色素，但因其与水互溶较难分离[14]，乙腈作为主流提取溶剂具有最佳的提取效果。净化剂中的PSA 用于吸附极性有机酸、脂类和糖类，GCB用于吸附甾醇和色素类杂质，但过量的GCB会吸附平面结构的农药，造成部分农药回收率降低[15]。本研究确定PSA的最佳用量为100 mg，GCB的最佳用量为10 mg，回收率最高达到93.42%，表现出较好的回收效果。18种有机磷农药在0.05～2.00 mg·L-1范围内线性良好(r2>0.99)；在0.05、0.10 和 0.50 mg· kg-1水平的平均回收率介于61.25%～119.68%，相对标准偏差RSD(n=6)均小于5.0%，说明本方法具有较好的准确度和稳定性。

本研究建立了运用GC-MS/MS 前处理技术，结合GC-MS/MS对常见18种有机磷农药进行分析检测，通过改善提取溶剂、质谱参数、不同分散剂比例，取得较好的检测效果。该方法具有简便高效、经济节约、结果准确等特点，适合有机磷农药在香葱、大蒜、洋葱、生姜、韭菜、青椒和红椒等样品中的定量检测与分析。