海参多肽微囊制备工艺

喻樊 *，陈倩，蔡伶丽

1.江苏省肿瘤靶向纳米诊疗材料工程研究中心，盐城师范学院（盐城 224007）；2.盐城师范学院药学院（盐城 224051）

海参多肽（sea cucumber peptide）食用安全，易消化吸收，并且具有降血压、降低胆固醇、抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、提高免疫力、促进矿物吸收、延缓衰老等生物活性[1-3]，近年来的关注度越来越高。但是多肽属于热敏性的物质，阳光、空气及温度都会使其因降解而失活，从而大幅降低其营养及保健价值。微囊（microcapsule）是近40年应用于食品和药品的载体，具有掩盖药物的不良气味，提高药物的稳定性及显著延长药效、降低毒性、提高活性和生物利用度等优点，试验探究海参多肽微囊的制备工艺，旨在提高口服生物利用度及稳定性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

木瓜蛋白酶（≥1 000 U/mg，上海蓝季生物）；乳铁蛋白粉（食品级，河南万邦实业有限公司）；淡干海参（烟台瑞参堂水产有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

紫外光谱（UV-1800，SHIMADZU）；红外光谱（TENSORⅡ，BRUKER）；冷冻干燥机（FD-1D-80，北京博医康实验仪器有限公司）；研磨机（IKA，TUBE-MILL）；实验型喷雾干燥机（SP-1500，上海顺仪实验设备有限公司）；紫外分光光度计（Lambda 950，美国PE公司）；扫描电子显微镜（Quanta 200，荷兰FEI公司）。

1.3 海参多肽的制备

分别取0.2，0.8和1.0 g干海参粉，均加150 mL水，调pH至8.0。加入木瓜蛋白酶[13]，加酶量12%。将其放入水浴锅中，于55 ℃恒温水解8 h。待其酶解完成后，置于沸水浴中10 min，使酶失活。静置冷却后，以转速4 000 r/min离心20 min，除去杂质后，取其上清液，待水解液浓缩后，进行冷冻干燥36 h，从而制得海参多肽。海参多肽得率按式（1）计算。

1.4 海参多肽微囊的制备

取0.2 g按1.3小节的方法制备的海参多肽，溶解在50 mL的2%的乳铁蛋白溶液中，并对其进行磁力搅拌。搅拌完成后对其进行喷雾干燥。设置喷雾干燥条件：进风温度170 ℃、进样速度7.0 mL/min、风机频率45 Hz。

1.5 单因素试验优化微囊喷雾干燥工艺

1.5.1 进风温度

在乳铁蛋白溶液浓度2%、进样速度7.0 mL/min、风机频率45 Hz条件下，选择170，180和190 ℃ 3个不同进风温度开展试验，制得微囊。在三目生物显微镜下观察微囊的形态，对其进行分析比较。

1.5.2 进样速度

在乳铁蛋白溶液浓度2%、进风温度170 ℃、风机频率45 Hz条件下，选择7.0，8.0和10.0 mL/min 3个不同进样速度进样，制得微囊。在三目生物显微镜下观察微囊的形态，对其进行分析比较。

1.5.3 风机频率

在乳铁蛋白溶液浓度2%、进风温度170 ℃、进样速度7.0 mL/min条件下，选择30，45和50 Hz 3个不同的风机频率进样，制得微囊。在三目生物显微镜下观察微囊的形态，对其进行分析比较。

1.6 微囊的显微观察

打开电镜主机和电脑工作软件，剪合适大小的导电胶贴于工作台上。取适量喷干后的微囊粉末（样品），置于导电胶上，涂抹均匀，用洗耳球挤压吹去多余粉末。喷金，将样品转移到工作室中，关闭工作舱。抽真空，待真空达到后，调整工作距离至10 mm。用扫描电子显微镜（SEM）在15 kV调正样品位置后，调整拍照位置和放大倍数进行拍照，形态好的保存图像，通过分析图像观测微囊形态[4-6]。

1.7 海参多肽微囊的表征

1.7.1 固体紫外的表征

取适量海参多肽、乳铁蛋白、空囊、物理混合和海参多肽微囊作为样品（所有样品必须为粉末状以便检测），用紫外可见分光光度计在室温（25 ℃）下对上述一系列样品进行扫描。采集分辨率4 cm-1在波长200～1 000 nm范围内的紫外吸收光谱，并用记事本保存数据，通过Orign 8.0软件进行作图分析。

1.7.2 红外的表征

采用KBr压片法进行红外光谱的测定。打开红外光谱仪及电脑工作软件，在制片前用丙酮擦拭研钵及其他工具，在红外灯光照下，制备溴化钾空白片和样品压片（样品5种，海参多肽、乳铁蛋白、空囊、海参多肽与乳铁蛋白物理混合、载药囊，与溴化钾混合比例为1∶100～1∶200）。将压好的溴化钾空白片，放入样品架上，点击数据采集，作为背景谱图，采集完毕后，将样品片放入光谱仪在4 000～400 cm-1检测红外吸收光谱。并用Excel保存数据点表后，运用Origin 8.0软件分析谱图。

1.7.3 差示扫描量热法（DSC）的表征

取适量海参多肽、乳铁蛋白、空囊、物理混合和海参多肽微囊作为样品，以空白坩埚为参比，以10℃/min的扫描速率升温，在25～400 ℃扫描[7-8]。

1.7.4 X射线衍射法（XRD）的表征

取适量海参多肽、乳铁蛋白、空囊、物理混合和海参多肽微囊，作为样品进行XRD分析，检测的条件为Cu靶，K线；扫描方式：定性，步进扫描；管压40 kV，管流30 mA，扫描步长0.02°，扫描范围10°～80°，扫描速度2°/min。取干燥后的样品研磨，压片，置于X射线粉末衍射仪上，设置衍射参数（10°～80°，10°/min）[9]。

2 结果与分析

2.1 海参多肽的得率

按1.3小节的方法制备海参多肽，分别水解0.2，0.8和1.0 g海参粉。计算结果显示，得率为69.50%±2.53%。

2.2 单因素试验优化微囊喷雾干燥工艺结果分析

2.2.1 进风温度

进风温度愈低，会导致液滴不完全干燥而粘于玻璃壁上，使得粉末收率大幅降低，并且极易堵塞喷嘴，造成喷雾中断。进风温度愈高，会使液滴表面溶液迅速挥发，囊内外温度还未平衡完全便形成硬囊壳，包于囊内的剩余溶剂会进一步迅速挥发使得囊壳破裂[10]。随着温度升高，微囊变得越来越干瘪，有些破裂并且体积越来越小。170 ℃下的微囊形态较圆整光滑。因此，进风温度170 ℃比较适宜。

2.2.2 进样速度

进样的快慢会影响微囊在干燥室中干燥的过程。7.0 mL/min流速下的微囊形态较圆整，并且粒径大小均一。8.0 mL/min下的微囊有干瘪，10.0 mL/min条件下的微囊形态或大或小。因此，进样速度7.0 mL/min比较适宜。

2.2.3 风机频率

风机频率的不同会影响微囊在干燥室中的干燥过程。30 Hz下的微囊干瘪且有破裂；45 Hz下的微囊较为圆整，粒径均一；60 Hz下的微囊干瘪，粒径或大或小。因此，风机频率45 Hz比较适宜。

2.3 海参多肽微囊的形态

从图1（B）中可以看出，制备的海参多肽微囊表面光滑、粒径大小适宜，无粘连。没有发现囊芯物海参多肽，说明海参多肽成功包覆于囊中。在电镜观察发现微囊形态干瘪，粒径均匀，如图1（B）所示；由电镜低分倍率下观测可以发现微囊成囊率高破损较少。在电镜高分倍测可知微囊粒径适宜，如图1（C）所示，符合标准。

图1 SEM图

2.4 固体紫外谱图的分析

图2中从上往下依次是海参多肽、乳铁蛋白、空囊、物理混合及海参多肽微囊，分别用紫外分光光度计测得数据，以Origin 8.0软件处理得到的叠加紫外图谱。

从图2（A）看出，海参多肽在200～220 nm处有强吸收，因为海参多肽含有谷氨酸，为芳环的双键吸收。在230 nm有一个吸收峰，可能是羟基或氨基。在260～300 nm有弱吸收，可能是生色基团羰基。从图2（B）看出，乳铁蛋白在340 nm处有特征吸收峰，存在几个共轭体系。空囊（图2 C）在220 nm处有一吸收峰是因为肽键引起的，在283 nm处有一吸收峰是由于含酪氨酸残基和色氨酸残基。图2（D）为物理混合，主要体现海参多肽的吸收峰。与空囊相比，图2（E）的吸收峰不明显，但能说明海参多肽包覆于囊中。

图2 固体紫外图谱

2.5 红外谱图的分析

图3中从上往下依次是海参多肽、乳铁蛋白、空囊、物理混合及海参多肽微囊，分别用红外光谱仪测得数据，以Origin 8.0软件处理得到的叠加红外图谱。

海参多肽中含有大量氨基酸，从图3（A）可以看出，3 317 cm-1处的吸收峰说明海参多肽中存在—OH基团。1 655 cm-1处为C＝O伸缩振动，1 401 cm-1处为C—N伸缩振动，说明海参多肽中存在酰胺键。1 238 cm-1处为N—H弯曲振动或C—N伸缩振动。1 035 cm-1处为C—O伸缩振动，说明海参多肽存在羧基。675 cm-1处为—NH2的面外弯曲振动。另外，在2 930 cm-1处为饱和的C—H的伸缩振动，1 542 cm-1处的峰位为C＝C双键的伸缩振动，表明多肽中存在—C＝C基团。

从图3（B和C）可以看出，乳铁蛋白在3 422 cm-1处有酰胺基伸缩振动产生的特征吸收峰；1 647 cm-1处为基团—C＝O特征吸收峰。1 038 cm-1处为C—O伸缩振动；1 394 cm-1处的峰位为C—N伸缩振动，是乳铁蛋白的特征吸收峰。另外，1 537 cm-1处的峰位为C＝C双键的伸缩振动，说明乳铁蛋白中存在—C＝C基团。

从图3（D）可以看出，物理混合在3 732 cm-1处有—OH的吸收峰，可能是—OH形成分子内氢键；3 311 cm-1处为—OH的特征吸收峰，929 cm-1处为饱和的C—H的伸缩振动，1 652 cm-1处为—C＝O伸缩振动，1 538 cm-1处的峰位为C＝C伸缩振动，1 397 cm-1处的峰位为C—N伸缩振动，1 036 cm-1处为C—O伸缩振动，在指纹区676 cm-1也有一处吸收峰。分析可知，物理混合主要体现海参多肽的特征吸收峰。

观察海参多肽微囊红外图谱，从图3（E）分析出，2 930 cm-1处为饱和的C—H伸缩振动，1 655 cm-1处为C＝O伸缩振动，在1 401 cm-1处为C—N伸缩振动为伯酰胺基的特征吸收峰。在指纹区有2个吸收峰，但在3 317 cm-1左右没有吸收。另外，在1 035 cm-1处为C—O伸缩振动，1 542 cm-1处为C＝C双键伸缩振动。分析可知，海参多肽被包进乳铁蛋白中，微囊制备成功。

图3 红外图谱

2.6 X射线衍射法（XRD）的分析

图4中从上往下依次是海参多肽、乳铁蛋白、空囊、物理混合及海参多肽微囊，分别用XRD测得数据，以Origin 8.0软件处理得到的叠加XRD图谱。

图4 XRD图谱

图4（A）中海参多肽在2θ=23°处存在特征衍射峰。乳铁蛋白在图4（B）中出现2θ=19°，这是乳铁蛋白的特征峰。图4（D）为海参多肽与乳铁蛋白的物理混合，可以看出衍射峰强度减弱，这是因为海参多肽与乳铁蛋白相互作用导致。图4（E）为海参多肽微囊，可以看出在2θ=19°处存在衍射峰，海参多肽的特征峰消失，说明海参多肽被成功包裹在微囊中。

3 结论

试验采用喷雾干燥法制备海参多肽微囊，操作简便，便于控制，不需要有机溶剂，适合工业化的生产[11-13]。通过单因素试验确定微囊的最佳喷雾干燥工艺：进风温度170 ℃、进样速度7.0 mL/min、风机频率45 Hz。通过扫描电镜观察到此工艺下制得的微囊表面光滑、粒径均一、无粘连现象。通过固体紫外、红外和XRD对海参多肽、乳铁蛋白、微囊等进行一系列表征，分析得出海参多肽被包于微囊内，并且以无定型形式存在。通过对喷雾干燥法制备海参多肽微囊的初略研究，表明该工艺具有一次成囊、迅速、较适合工业化生产的特点。