基于microRNA探讨电针延缓HepG2裸鼠荷瘤生长趋势效应的初步机制

方 杰，吴叶琪，黄雪燕，王 睿

(1杭州医学院，浙江省实验动物与安全性研究重点实验室·浙江 杭州 310013；2浙江中医药大学附属杭州市中医院·浙江 杭州 310007)

原发性肝细胞癌具有高发病率和高死亡率的特点[1]，我国是肝癌高发地区[2]，给社会带来极高的危害和负担。手术、放化疗及靶向药物是治疗本病的三大支柱疗法，但因肝癌发病隐匿，部分基层单位医疗和经济条件有限，缺少有效监测手段，故多数患者在确诊时已是中晚期阶段[3]。如何有效提高中晚期肝癌病人的生存时间和质量，是目前面临的一个医学难题。相较于肿瘤免疫治疗的高昂费用[4]，我国传统医学具有“简验效廉”的特色优势，尤其对于部分经济困难的家庭和基层单位，是患者实现“带瘤生存”的补充替代手段。相关研究证据表明，电针疗法在肿瘤并发症和副作用的改善方面具有明确优势[5-7]，但对于其直接正向调控肿瘤生长的研究略显薄弱[8-9]。因此，本研究基于microRNAs(miRNAs)测序技术，选择操作标准易于量化的电针作为干预方法，尝试发掘电针延缓HepG2肝细胞癌裸鼠荷瘤生长的效应靶点，为后续探讨针灸与肿瘤免疫抑制状态的相关性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞 4周龄健康SPF级BALB/c-nude小鼠20只，雌雄各半，体质量18～20 g。由杭州医学院实验动物中心负责调剂，动物生产许可证号SCXK(浙)2019-0002；于该单位屏障室内常规饲养，动物使用许可证号SYXK(浙)2019-0011。室内温度(24±2)℃，湿度40%～60%，自由饮水，明暗时间各12 h。荧光素酶(Luciferase, Luc)标记的人源肝癌细胞株HepG2-Luc购于中国科学院上海细胞库。

1.2 实验试剂 DMEM培养基：Hyclone公司；RPMI-1640培养液：Sigma公司；胎牛血清(FBS)： Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)：北京中科迈晨科技有限公司；胰酶消化液：Biosharp公司；异氟烷(R510-22)：深圳市瑞沃德生命科技有限公司；逆转录试剂盒：广州市锐博生物科技有限公司；合成引物：广州市锐博生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 0.16 mm×7 mm面针(500PCS)：长春爱康医疗器械有限公司；SDZ-II华佗牌电针仪：苏州医疗用品厂有限公司；ZH-XBQ小鼠固定器、IVIS Spectrum小动物活体成像仪：PerkinElmer公司；RC2啮齿动物气体麻醉机：VetEquip公司)；7500 Quantitative PCR(qPCR)仪：ABI公司；Veriti逆转录仪：ABI公司。

1.4 动物分组和模型制备 造模前予常规适应性喂养1周，按裸鼠体质量的顺序进行排列，采用随机数字法分为电针组(Electroacupuncture group, EG)和对照组(Control group, CG)，剪趾法编号，每组各10只。 HepG2-Luc细胞置于含10% FBS的DMEM细胞培养液中进行培养和传代，使用RPMI1640培养液配制为2×107/mL细胞。于EG及CG组裸鼠右前肢腋窝下，接种浓度2×107/mL的HepG2-Luc细胞悬液0.2 mL(含有活细胞4×106)。接种细胞后每日定时观察裸鼠细胞接种部位的成瘤情况，1周后使用小动物活体成像仪确认裸鼠模型瘤块形成情况。

1.5 干预措施 EG组：1)取穴参考《实验针灸学》[10]选取双侧足三里及三阴交穴。2)操作：呼入式小动物麻醉机麻醉裸鼠5 min后，采用小鼠尾静脉注射固定器配合双下肢医用胶布捆绑法固定裸鼠，使用15°斜刺法刺入上述穴位。电针仪频率选择2/100 Hz疏密波，电流强度从0.1 mA开始逐渐加强，根据裸鼠耐受情况，以身体开始扭动为度。CG组：使用相同方式进行呼入式气体麻醉及固定，不予其它特殊处理。确认造模成功起，各组每日干预1次，每次30 min，连续14 d。

1.6 荷瘤生长效应检测 于干预开始当天至实验结束次日，使用电子游标卡尺测算EG及CG组裸鼠皮下荷瘤体积(V=ab2/2，a为荷瘤长径，b为短径)；在干预开始当天、第5、8、13及结束次日，使用小动物成像系统采集两组裸鼠皮下荷瘤的荧光值，以计算荷瘤变化趋势。

1.7 样本采集与保存 末次电针干预后次日处死裸鼠，在冰块上快速分离荷瘤组织。放入PBS缓冲液将组织洗净并用滤纸吸干，迅速将所取样品放入RNA保存液中，并用干冰保存，立即转至广州锐博生物科技有限公司检测。

1.8 总RNA提取与RNA-seq高通量测序 Trizol法提取组织总RNA，利用Qubit®2.0和Agilent 2200 TapeStation对总RNA进行质检。利用NEBNext®Multiplex small RNA Library Prep Set for Illumina(NEB, USA)制备小RNA文库，然后用HiSeq 2500(Illumina, USA)进行SE-50测序。miRNA的表达水平通过RPM(Reads Per Million)值进行标准化[PRM=(映射到miRNA的Reads数/Clean数据中的Reads数)×106]。

1.9 miRNA差异基因筛选及qPCR验证 以|log2(Fold Change)|≥1，P<0.05为标准，采用edgeR算法计算两组样本间差异表达量，并利用R软件中的gplots包对筛选出的差异miRNAs绘制热图。同时利用TargetScan、miRDB、miRTarBase和miRWalk预测差异表达miRNAs的靶基因，以进行GO及KEGG功能富集分析。最后使用qPCR验证组间样本差异表达的miRNAs。

2 结果

2.1 两组裸鼠荷瘤生长延缓效应比较 电针开始干预至实验完成时荷瘤体积每日的变化趋势比较，差异有统计学意义(P<0.05)，图1；小动物活体成像仪采集的成像数据显示两组裸鼠荷瘤变化趋势，组间差异有统计学意义(P<0.05)，图2。

图1 两组裸鼠荷瘤体积每日变化趋势比较

图2 两组裸鼠荷瘤活体成像荧光值变化趋势比较

2.2 两组间表达差异的miRNAs及其靶基因生物信息学预测分析 (1)与CG组比较，EG组HepG2裸鼠皮下荷瘤组织差异表达miRNAs有24个，其中上调的有20个，下调的有4个；表达变化差异倍数大于5倍的有17个。(2)对24个miRNAs靶基因预测进行GO分析的结果显示，参与分子功能(molecular function)的基因有9 929个，主要涉及细胞转化(cellular process)等；参与细胞组成(Cellular Component)的基因有11 214个，主要涉及细胞成分(cell part)、细胞内结构(intracellular part)及膜结合相关的细胞器(membrane-bounded organelle)等；参与生物过程(Biological Process)的基因有5 697个，主要涉及蛋白结合(protein binding)等。(3)进行KEGG显著富集通路分析的结果显示，主要涉及的通路有30 个，相关性最强的前三位分别是内质网相关的蛋白代谢(Protein processing in endoplasmic reticulum)、胃酸分泌途径(Gastric acid secretion)、轴突导向过程(Axon guidance)；靶基因聚集数量排名前三的依次为代谢通路(Metabolic pathways)、肿瘤相关通路(Pathways in cancer)及MAPK信号通路。见图3 A/B。

2.3 miRNAs测序结果分析及qPCR验证 根据组间miRNAs的表达量、差异倍数及查阅现有文献等综合方法，继而选择15个miRNAs进行qPCR验证。结果发现，经qPCR验证仅miR-144-3p、miR-486-5p、miR-487b-3p及miR-451a表达水平的差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图3 C/D。

表1 经qPCR验证的差异显著miRNAs(EG vs.CG)

图3 A.GO分析；B.KEGG分析；C.miRNAs测序结果分析热图；D.miRNAs组间qPCR验证结果比较

3 讨论

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌最常见的组织学类型，严重威胁人类健康，是目前全球面临的一个重大医学难题[11]。根据GLOBOCAN 2018年公布的癌症数据，全球肝癌年新发病例约有84.1万例，发病率4.7%，居恶性肿瘤第6 位；死亡病例78.1万例，死亡率高达8.2%，仅次于肺癌位居世界第二[12]。我国每年约有46.6万新增肝癌病例，约42.2万人死于肝癌，占据全球肝癌死亡人数一半以上[13]。目前手术治疗依然是早期肝癌获得根治的主要途径，而对于中晚期患者多选择经导管动脉化疗栓塞术、局部消融治疗、系统性治疗等各种非手术治疗手段[1]。但大多数患者在确诊时已是晚期或是发生了转移，失去了手术根治的机会，且病情进展迅速，即使采用放化疗和靶向药物方案，因副作用大、耐药性、易复发、转移等特点，患者预后仍不理想[14-15]。

中医作为我国传统医学的瑰宝，是肿瘤防治重要的补充替代手段，在国内具有极为广泛的群众基础。其作用已不再局限于改善肿瘤兼症，而是着眼于提高患者“带瘤生存”能力，尤其是对于无法耐受常规治疗手段的高龄及中晚期患者，可通过中药内服、针灸外治以调和阴阳、固护正气，促使机体内环境重新达到平衡状态。其中，针灸结合经络腧穴的自身特性和针刺补泻原则，起到补虚泻实的作用，可以调整人体异常的脏腑功能，激活疏通经气。课题组选用的足三里和三阴交是经典的表里经配穴组合，本就是补益脾胃，滋养后天之本的要穴；足三里更是因其独特的经穴效应，被用予研究穴位生物学机理的载体。与其他软坚散结、祛湿涤痰或清热解毒的肿瘤治法不同，针灸可以通过固护正气，正向调控机体免疫功能，改善肿瘤免疫抑制微环境[16-17]，成为发挥延缓肿瘤生长趋势效应的有效手段。

本研究结果发现，通过监测干预期间皮下荷瘤体积变化情况，证实电针刺激对于延缓HepG2肝癌裸鼠荷瘤的生长趋势具有一定的效应，与课题组前期研究[18]及其他学者的报道结果相近[19-20]，部分针灸相关的临床研究也间接佐证了其在延长肿瘤患者生存时间上的作用潜力[21-23]。但电针效应的发挥是极为复杂的网状调控关系，无法通过单一信号通路解释，除了调控免疫抑制微环境外，还可能对肿瘤结构和功能(血管新生)[8]、炎性反应[9]及生物节律[24]等有影响。但电针以其“简便、安全、经济、操作可标准化”等独特优势，作为协同疗法或基层适宜技术辅助推广，具有重要的生命力。

通过开展电针组和模型组荷瘤组织miRNAs测序分析及qPCR验证，发现4个miRNAs组间表达具有显著的统计学差异，为开展进一步细胞实验验证奠定了基础。同时，GO分析及KEGG分析结果，也将电针缓瘤效应的生物学靶点聚焦到了参与细胞组成的蛋白代谢和肿瘤炎症相关通路，系统综合双方结果为后续寻找靶基因提供了重要参考。通过挖掘电针调控miRNAs的上下游机制，成功挖掘电针延缓HepG2肝癌裸鼠荷瘤生长趋势的生物学效应原理，是能否在临床发挥针灸控瘤，提高患者“带瘤生存”能力的前提条件之一，亦是课题组后续重要的研究方向。