基于肺胃同治法探讨肃肺和胃汤对反流性胃肺疾病大鼠肺胃组织PKA、cAMP、SP及TRPV1蛋白表达的影响

崔金瑜，汝触会，陈爱凤，陈 晔，晏露宁，韩佳颖，何 飞

(1浙江大学医学院附属杭州市胸科医院呼吸与危重症医学科·浙江 杭州 310003；2浙江中医药大学附属第二医院呼吸与危重症医学科·浙江 杭州 310005)

脏腑相关理论是中医藏象学说的重要内容，其在肺系疾病中应用尤为突出[1]，肺胃同治、肺肠同治等一系列脏腑同治方法应用广泛。肺胃在人体生命活动中有重要作用，肺胃相关理论已广泛应用于临床，采用肺胃同治法治疗胃食管反流性肺系疾病的临床实践行之有效[2-4]，但其作用机制尚不完全明确，需要进一步深入阐释其内在的本质联系。胃食管返流病机为胃失和降，肺气上逆，治以肃肺和胃降逆, 肃肺和胃汤是本院呼吸科中药协定方，治疗胃食管反流性咳嗽具有一定疗效。在前期研究中，笔者发现在反流性胃食管肺黏膜慢性炎症与大鼠模型肺胃组织P 物质(SP)表达呈相关性，SP可能是中医肺胃相关理论的物质基础，但缺乏进一步的分子机制研究[5]。本研究观察肃肺和胃汤对反流性胃肺疾病大鼠肺与胃组织 PKA、 cAMP、 SP 表达及肺组织磷酸化 PKA、TRPV1 表达的影响，进一步研究肺胃同治法治疗胃食管反流性肺系疾病的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性健康成年SD大鼠30只，体质量(200±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证编号：20170005028404，许可证编号：SCXK(沪)2017-0005。实验动物饲养于浙江中医药大学SPF级动物房，实验动物的处置严格遵守浙江中医药大学动物实验中心的伦理相关规定进行。

1.2 实验药物和试剂 肃肺和胃汤(旋复花、苏子、半夏、黄芩、干姜、党参、黄连、大枣、甘草)由浙江大学医学院附属杭州市胸科医院中药制剂室制成流浸膏，生药含量1 g/mL，饮片采购于浙江中医药大学中药饮片有限公司。雷尼替丁胶囊：瑞阳制药有限公司，药品批号:19061902，规格：150 mg/粒。DAB kit：MDL公司； Anti-PKA beta(catalytic subunit)抗体：美国Abcam公司；Anti-cAMP蛋白Kinase Catalytic subunit抗体：美国Abcam公司；Anti-Substance P抗体：美国Abcam公司；Anti-GAPDH抗体：美国Abcam公司；PKA alpha/beta/gamma CAT 抗体：美国Affinity公司。

1.3 实验仪器 ASP200S全自动脱水机：德国Leica公司；EPS300电泳仪：中国天能公司；VE180C电泳槽：中国天能公司；VE186转膜仪：中国天能公司；G1150 H加热石蜡包埋系统：德国Leica公司；GL-5250A加热磁力搅拌器：KyLin-Bell Lab Instruments公司；DM3000正置荧光显微镜：德国Leica公司；NIKON DS-U3成像系统：日本尼康公司。

2 实验方法

2.1 动物分组及造模 将30只大鼠随机分为5组，即正常对照组、模型组、中药组、西药组、中西医结合组，每组6只。采用慢性食管内灌注盐酸(含蛋白酶)方法建立反流性胃肺黏膜慢性炎症大鼠模型[6]。将2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，经口插入胃管至食管中、下段，除正常对照组外，以8滴/min的速率缓慢灌注0.1 mmol/L盐酸(含0.5%胃蛋白酶)溶液，每次20 min，每天1次，连续14 d。正常对照组用PBS液代替盐酸，方法与模型组相同。中药组和西药组从造模第15天开始分别予肃肺和胃汤流浸膏(6.7 g/kg)和雷尼替丁(27 mg/kg)，中西医结合组同时给予同剂量肃肺和胃汤流浸膏和雷尼替丁药物，正常对照组及胃食管反流模型组给予同剂量生理盐水，直到第21天。给药途径均采用灌胃，每日1次。

2.2 标本采集 腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)麻醉大鼠，心脏穿刺放血处死动物。立即在冰块上取出肺及胃食管组织，分离右下肺及胃窦部(0.5 cm×1cm)，取两者其中部分组织作病理学检查。两者的剩余部分放入容器保存于-80 ℃冰箱备用。

2.3 观察指标及测定

2.3.1 光镜下观察肺、胃组织病理学变化 对标本取材、脱水、包埋和切片后，进行HE染色，通过显微镜拍照(100倍和200倍)，采集分析样本相关部位，并进行HE半定量分析。肺部炎症病理分级采取半定量方法评估其炎症严重度[7]，0分：无炎症细胞；1分：少许炎症细胞，肺泡壁正常；2分：炎症细胞成环状，层厚为1个细胞，肺泡壁轻度增厚，肺泡腔内及较多巨噬细胞、中性粒细胞；3分：炎症细胞成环状，层厚为2～4个细胞，肺泡壁显著增厚，肺泡内可及30%～50%巨噬细胞、中性粒细胞；4分：炎症细胞成环状，层厚>4个细胞，肺泡壁显著增厚，肺泡内>50%巨噬细胞、中性粒细胞浸润；5分：完全实变。胃黏膜炎症程度根据黏膜中慢性炎症细胞的浸润程度进行评分[8]。

2.3.2 免疫组织化学方法测定大鼠肺、胃组织PKA、cAMP、SP表达 大鼠肺与胃组织分别放入10%中性甲醛中固定，取材包埋，石蜡包埋切片。经抗原修复后行免疫杂交：切片经 PBS 冲洗，滴封闭液(5%BSA)，室温孵育30 min。用滤纸擦去封闭液，滴加适宜浓度的PKA、cAMP与SP一抗(均1∶50)置湿盒中4 ℃孵育过夜，再用PBS 洗去一抗，用滤纸擦去PBS。滴加生物素化二抗，室温孵育20 min，用PBS洗去二抗，用滤纸擦去PBS。滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育20 min，用PBS洗去，用滤纸擦去PBS。DAB显色剂显色，自来水冲洗。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。10×40倍显微镜选取各组大鼠肺与胃组织切片各6张，观察阳性反应(镜下棕黄色表现)，测定平均光密度值(AOD)。

2.3.3 Western blot检测大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1蛋白表达 各取100 mg大鼠肺、胃组织样品，剪碎，组织匀浆机中进行匀浆，冰上静置裂解15～30 min。将匀浆液离心，取上清，测浓度。BCA法测出浓度后，进行蛋白变性，沸水煮 5 min，室温冷却，-20 ℃保存。进行SDS-PAGE电泳和转膜，转膜结束后，取出PVDF膜并作好标记，用TBST洗膜。免疫印迹：将PVDF膜放入孵育盒中，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡1.5～2 h进行封闭；封闭结束后，用TBST洗膜，将膜放入含一抗稀释液的孵育盒中，4 ℃摇床振荡孵育过夜后取出，室温振荡30 min，吸弃一抗，TBST洗10 min×3次；用5%脱脂奶粉封闭液稀释二抗，室温摇床振荡反应1～2 h；二抗反应结束后，回收二抗。然后用TBST洗膜5～10 min×3次。使用ECL化学发光仪显影拍摄，保存图像。用酶标仪测定各标本吸光度。

3 结果

3.1 各组大鼠肺、胃组织病理形态学变化 模型组大鼠肺组织可见大量的炎性细胞浸润，胃组织胃黏膜上皮出现胃黏膜下间质水肿、黏膜下可见炎细胞浸润。各给药组大鼠肺、胃组织病理损伤程度较模型组为轻。见图1，表1。

图1 各组大鼠肺胃组织病理形态学改变(HE，×200)

表1 各组大鼠肺、胃组织炎症病理半定量积分比较分)

3.2 各组大鼠肺、胃组织PKA、cAMP与SP表达的免疫组化检测结果 见图2～图4，表2。

图2 各组大鼠肺、胃组织PKA表达的免疫组化检测结果(×400)

图3 各组大鼠肺、胃组织cAMP表达的免疫组化接测结果(×400)

图4 各组大鼠肺、胃组织SP表达的免疫组化检测结果(×400)

表2 各组大鼠肺、胃组织PKA、cAMP、SP表达的免疫组化检测结果比较值)

3.3 各组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1蛋白表达的Western blot检测结果 见图5。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01(动物数：6 只)图5 各组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1蛋白表达的Western Blot检测结果及比较

与正常对照组比较，模型组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1的蛋白表达水平均极显著升高(P<0.01)；与模型组比较，中药组、西药组和中西医结合组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)，其中，中西医结合组蛋白降低程度最明显。

4 讨论

反流性胃肺疾病是指胃食管反流性疾病并发肺部病变，最常见的是胃食管反流性咳嗽。肺胃相关理论在此类疾病中有着重要体现，前期研究表明SP可能是中医肺胃相关理论的物质基础[5]，为该理论提供了现代研究的实验依据。

神经-内分泌-免疫网络中指出，蛋白激酶 A(PKA)、环腺苷酸(cAMP)、P 物质(SP)对上述信号传递可能存在主要的影响[9]。cAMP 由腺苷酸环化酶催化 ATP 反应生成，而cAMP 对细胞的调节功能主要是通过激活依赖 cAMP 的 PKA 来实现。瞬时感受器电位香草酸受体 1(TRPV1)是瞬时受体感受器电位通道的成员之一。最早是由Caterina等[10]发现，可被辣椒素激活，是一种非选择性阳离子通道,广泛分布于呼吸系统、消化系统、心血管系统、泌尿系统等。在呼吸系统主要分布于气管、支气管及肺泡的神经轴突，咳嗽患者的TPRV1表达增加，TPRV1通道有可能成为治疗咳嗽的有效靶向药物[11]。笔者推测激活后的PKA/cAMP信号通路，促使下游靶蛋白磷酸化，使TRPV1通道开放，Na+、Ca2+等阳离子内流增加，从而使肺胃组织释放神经肽类SP，可能介导了反流性胃肺疾病的病理生理过程。本课题研究发现：与正常对照组比较，模型组大鼠肺、胃组织PKA、cAMP与SP的蛋白表达量均显著升高(P<0.01)，而Western blot检测结果表明大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1的蛋白表达水平均显著升高(P<0.01或<0.05)。说明PKA/cAMP信号通路及TRPV1、SP参与了反流性胃肺疾病病理生理过程。

中医认为五脏六腑皆令人咳，非独肺也，胃失和降,则肺不布津,水湿停胃而为痰为饮,又可上逆犯肺而为咳变。中医从肺胃同治法入手治疗胃食管反流咳嗽临床取得了较好的临床疗效。肃肺和胃汤是本院科室制剂，由半夏泻心汤化裁而来，主要药物有旋复花、苏子、半夏、黄芩、干姜、党参、黄连、大枣、甘草。方中苏子降气止咳；旋复花、半夏降逆止呕、化痰散结；干姜温中散寒，其温中之功可助半夏温化寒痰；黄芩、黄连清热燥湿,苦寒泄降,善清泄肺胃之热；党参、大枣健脾益气，甘草调和诸药。该方辛开苦降，寒温并用，肺胃同治。本研究结果表明：与模型组比较，中西医结合组和西药组大鼠肺组织PKA、cAMP与SP的蛋白表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)，中药组、西药组及中西医结合组大鼠胃组织PKA、cAMP和SP蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)，中西医结合组较中药组PKA、cAMP和SP蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)。中西医结合组和西药组3 个指标差异无统计学意义(P>0.05)。同时，与模型组比较，中药组、西药组和中西医结合组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。提示各给药组治疗反流性胃肺疾病能更好地阻断PKA/cAMP 信号通路，减少TRPV1和SP的激活释放，从而降低咳嗽的敏感性。虽然中西医结合组和西医组差异无统计学意义，但中西医结合组各类指标下降程度更明显，后续研究过程中可适当提高各组样本量，同时分组过程中可增加西药半量联合中医组，更能体现中医增效作用及中西医结合治疗的优势。