光纤耦合微通道反应系统原位监测海水氨氮和亚硝酸盐的研究

姜双城 ，杜虹，郑惠东，汤新华 ，潘文涛，高俊，范丹阳，林琪*，吕海霞，林旭聪,

( 1. 福建省水产研究所，福建 厦门 361013；2. 汕头大学 理学院，广东 汕头 515063；3. 厦门斯坦道科学仪器股份有限公司，福建 厦门 361013；4. 福建省产品质量与食品安全检测试剂和仪器工程技术研究中心，福建 福州 350108；5. 福州大学 化学学院，福建 福州 350108)

1 引言

氨氮和亚硝酸盐是海水中营养盐的重要组成部分，当氨氮和亚硝酸盐浓度过高时，不仅会破坏水体氮循环的平衡，而且会导致藻类数量异常增加，引发水体富营养化，破坏海洋水体原有的生态平衡，并危害近海养殖业的健康发展，亟需监控[1-4]。随着国家蓝色海洋战略推进，营养盐监测需求日益增加，研发氨氮、亚硝酸盐等分析技术及其仪器设备，推进快速、准确的原位监测受到了广泛重视。

目前，海水中氨氮和亚硝酸盐的检测方法发展日趋成熟，主要包括分光光度法、荧光法和电化学法等。光谱法分析仪器操作简单、成本低，在海水中氨氮和亚硝酸盐现场检测中得到了广泛的应用。在氨氮检测方面，水杨酸-次氯酸钠比色法[5-6]、靛酚蓝分光光度[7]和邻苯二甲醛荧光法[8-9]得到了广泛的研究和 应 用；结 合 流 动 注 射 技 术，Šraj等[10]、Vrana等[11]和Zabiegala等[12]基于膜分离的气体扩散单元引入液芯波导流通处，消除海水盐度差影响，提出了海水痕量氨测定的新方法。对于亚硝酸盐，分光光度法[13-14]、化学发光法[15]和色谱法[16-17]等得到了长足的发展。基于Griess偶联反应，采用分光光度法实现了水样中的亚硝酸盐测定[18-19]；基于对氨基苯硫酚的偶氮化反应，发展了比色法和表面增强拉曼光谱（SERS）两种模式对亚硝酸根离子进行检测[20]。然而，值得注意的是，现有方法中的仪器对于荧光和分光光度普遍采用传统的光路检测模块，两种光分析方法原理不同、光路设计不同，通常难以在同一个检测模块中应用，需要分别开发不同的检测模块，这样就会导致检测仪器在检测元器件和反应流路上数量大幅增加。对于海洋原位监测仪器而言，集成化、小型化尤为重要，特别在浮标等载体狭小空间中，仪器的检测流程增加和元器件的增加，十分不利于仪器集成和高效利用。亟需开发可同时兼容荧光、分光光度法的原位监测成套技术和仪器，促进原位监测仪器的集成化、小型化。

针对上述问题，本文基于光纤波导技术，采用光波长切割、光纤波导和微通道反应Z型检测池等技术，提出了光纤耦合微通道反应系统，将不同波长和检测原理的氨氮荧光分析和亚硝酸盐光度分析模式耦合在同一套系统，实现了海水中氨氮荧光检测和亚硝酸盐吸光光度法的原位测定。本文采用光导纤维传感技术，将Y型光纤探头直接插入Z型微通道流通池中进行测定，光辐射经光纤传导、荧光激发和发射，将反应池中荧光光谱光纤接收传回信号检测器；或通过传导光纤经由Z型流通池直接吸收，实现光度法测定。实验分析讨论了荧光和可见光光度法检测模式切换分析的可行性，研究了温度、pH、盐度和浊度的变化对海水中氨氮、亚硝酸盐测定的影响，并对不同环境参数变化所引起的偏差进行了补偿校正，研发了一种光纤耦合微反应系统原位测定氨氮、亚硝酸盐的方法及仪器。应用于海水样品进行了分析和比对验证，实现了海水氨氮和亚硝酸盐原位监测仪器更好的集成化设计和应用。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

所需试剂：磺胺（分析纯，上海国药）、盐酸（分析纯，天津福晨化学试剂）、盐酸萘乙二胺（分析纯，南京化学试剂）、邻苯二甲醛（分析纯，阿拉丁试剂公司）、亚硫酸钠（分析纯，天津试剂）、四硼酸钠（分析纯，上海国药）、氯化铵（优级纯，上海国药）、亚硝酸钠（分析纯，西陇化工）。

氨氮标准溶液（1 000 mg/L）：优级纯氯化铵经100℃干燥，称取3.819 g溶于适量的超纯水，移入容量瓶中，用超纯水稀释至1 000 mL并混匀，溶液浓度为1 000 mg/L；其他浓度根据需要依次稀释得到。

亚硝酸钠标准溶液（1 000 mg/L）：亚硝酸钠经110～120℃干燥，准确称取0.150 g溶于适量的超纯水中，移入容量瓶用水稀释至100 mL并混匀，溶液浓度为1 000 mg/L；其他浓度根据需要依次稀释得到。

光纤耦合微通道反应系统（自制），使用前采用超纯水清洗管路和前端过滤单元；实验用水为超纯水（默克密理博公司，美国）。

2.2 光纤耦合微通道反应系统

如图1所示，氙灯光源发射的光波波段经由波长切割器选择，入射光经由Y型光纤一分为二，由传导光纤1和2分成两束相同状态的光，其中传导光纤1直接连接信号采集器，设置为参比光路，传导光纤2经由Z型微通道流通池，产生的光谱信息由信号采集系统采集，两者完成样品的吸光光度法测定；同时，传导光纤2与传导光纤3组成Y型光纤，传导光纤2入射样品激发产生荧光，传导光纤3在同侧方向上采集样品荧光并传输到信号采集器，完成荧光探测。

图1 光纤耦合微通道反应系统原位检测装置示意图Fig. 1 Schematic of the fiber-coupled micro-channel reaction system for in-situ detection

2.3 本法和标准方法的比对验证

在原位监测仪开展现场测试的同时，使用QCC15卡盖式采水器（2.5 L）采集水样，并用0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤水样；过滤后的样品，冷藏运输至实验室，实验室内水质分析准则依据《海洋监测规范第4部分：海水分析》（GB 17378.4-2007）[21]和《近岸海域环境监测规范》（HJ442-2008）[22]，氨氮和亚硝酸盐的测定使用连续流动分析仪（型号：Skalar San++)评价本法和标准方法测定结果的一致性。

3 结果与讨论

3.1 原位检测仪器光谱分析

依据2.2节，对于氨氮分析，如图2a所示，在碱性条件下，海水中的氨氮与邻苯二甲醛（OPA）、亚硫酸钠生成具有荧光性的异吲哚衍生物，在波长362 nm的入射光激发下产生波长425 nm的荧光，荧光信号随着氨氮的浓度增大而增强。如图2b所示，在酸性介质中，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，与显色剂盐酸萘乙二胺偶合生成红色偶氮染料，最大吸收波长为540 nm，吸光度信号随着亚硝酸盐浓度的增大而增大。实验表明，该方法建立的光纤耦合微通道反应系统中氨氮和亚硝酸盐的反应光谱特征，与文献报道[13-14]的基本一致，所建立的反应模块中荧光和可见光光度法检测的模式切换分析具有可行性。

图2 不同浓度氨氮的荧光光谱（a）和亚硝酸盐的吸收光谱（b）Fig. 2 Fluorescence spectra (a) and absorption spectra (b) of ammonia nitrogen and nitrite with different concentrations, respectively

3.2 不同环境因子对氨氮和亚硝酸盐测定的影响

3.2.1 海水温度对氨氮和亚硝酸盐测定的影响

如图3a所示，考察了海水温度对氨氮原位监测结果的影响，在24 h内每小时采样1次，曲线1（黑色，未恒温）的荧光信号波动较为激烈，荧光信号平均值为385，信号漂移值为-17.0%，水温对于氨氮检测的荧光强度影响较大。为了消除温度的影响，微通道反应系统（含Z型微通道流通池）采用加热装置加以温度控制，如曲线2（红色，恒温），荧光信号变化波动明显减少，荧光平均值为411，信号漂移值为-2.0%，数值较为稳定。同时，如图3b所示，氨氮的荧光信号也随着温度升高略有升高，25～30℃之间的荧光值相对较强，无明显提升，考虑到温度升高能耗较大且容易降低仪器元器件寿命，故实验选用25℃作为反应温度。

同时，实验考察了不同水温样品进入体系中对于亚硝酸盐的响应情况。如图3b所示，随着水温的增加，亚硝酸盐反应体系（540 nm处）吸光度值变化很小。结合上述研究结果，实验采用25℃为微反应体系的反应温度，该条件下荧光强度和吸光度检测稳定。

图3 温度对氨氮检测荧光强度（a）和亚硝酸盐吸光度（b）的影响Fig. 3 Effect of temperature on fluorescence intensity of ammonia nitrogen detection (a) and absorbance of nitrite (b)

3.2.2 pH对氨氮和亚硝酸盐测定的影响

实验分析了海水pH在6～10之间对氨氮测定荧光强度、亚硝酸盐测定吸光值的影响。如图4所示，随着海水pH的增大，氨氮测定的荧光强度基本保持在420左右，强度略有增强；亚硝酸盐测定的吸光值稳定，数值保持在0.20左右，研究表明海水pH变化对于氨氮测定的荧光强度、亚硝酸盐测定的吸光值影响较小，反应体系较为稳定。

图4 pH对反应荧光强度和吸光度的影响Fig. 4 Effects of pH on fluorescence intensity and absorbance of the reaction

3.2.3 盐度和浊度对氨氮和亚硝酸盐测定影响

如图5所示，随着海水盐度的增加，不同浓度的氨氮样品测定时，反应体系的荧光强度逐渐降低并趋向平稳，在盐度20～35之间基本稳定。另外，实验采用红土和泥沙调制不同浊度，通过0.45 μm滤膜过滤后测定氨氮浓度，考察浊度对氨氮测定的影响，如表1所示，对不同氨氮浓度的样品，前后测定误差较小，浊度对氨氮测定的误差为-6.6%～2.5%；氨氮浓度较高的样品测定误差较小，浊度对氨氮测定结果影响较弱。

图5 盐度对氨氮测定荧光强度的影响Fig. 5 Effects of salinity on fluorescence intensity for ammonia nitrogen detection

表1 浊度对氨氮测定的影响Table 1 Effects of turbidity on the determination of ammonia nitrogen

在亚硝酸盐测定方面，如图6所示，对于 NO-2浓度不变的海水样品，随着海水盐度（X轴）的增加， NO-2测定吸光度逐渐增强， NO-2测定输出值与真实值之间的变化量逐渐增大（Y轴）；同时，随着Z轴浊度的增加，NO-2测定输出值与真实值之间的变化更加明显。研究表明，盐度和浊度对于分光光度法检测亚硝酸盐测定的影响较大，需要进行合适的补偿校正。

图6 盐度-浊度-亚硝酸盐浓度变化量的曲面图Fig. 6 Surface plot of salinity-turbidity-nitrite concentration variation

（1）不同盐度下对亚硝酸盐吸光度影响的补偿校正

如图7所示，当海水盐度为20时，亚硝酸盐测定反应的吸光度较低，亚硝酸盐补偿前的测定值与真实值基本一致；当盐度大于20后，反应体系的吸光度值发生较大的变化，其吸光度（y）与盐度（x）呈正相关性，对盐度在20～35范围内的吸光度进行拟合，表达式为y=-0.000 08x2+0.005 4x+0.131 6，据此可以计算出不同盐度下吸光度的校正系数为0.881～0.950。因此，结合不同盐度时的吸光度、对应的校正系数以及标准溶液浓度测定曲线，可以实现对亚硝酸盐浓度进行校正和定量测定，如图7所示，亚硝酸盐浓度真实值与预测值间的相对误差不超过2.1%，可以有效控制盐度对亚硝酸盐测定的影响。

图7 不同盐度下亚硝酸盐预测值及盐度补偿结果Fig. 7 Predicted values of nitrite and salinity compensation results under different salinities

（2）浊度对吸光度的影响和补偿校正方程

研究表明，当浊度小于40 NTU时，吸光度值基本稳定，测定值与对照值较为接近；当浊度大于40 NTU时，随着浊度的增加，溶液吸光度值逐渐降低，从0.20降低至0.18，亚硝酸盐测定值偏离真实值较为明显，浊度带来的影响不可忽略。如图8所示，在浊度为40～120 NTU区间时，吸光度值与浊度呈显著负相关，亚硝酸盐浓度和真实浓度间的变化量（y）与浊度（x）的关系为y=0.116 2x-2.94，R²=0.999 7。结合不同浊度时的吸光度值和标准曲线模型即可进行浊度补偿，如图8所示，补偿后两者数字接近，有效消除浊度对亚硝酸盐测定的影响。

图8 不同浊度下亚硝酸盐溶液预测值及补偿结果Fig. 8 Predicted value and compensation result of nitrite under different turbidity

为了进一步说明补偿后的测定效果，采用整体平均偏差Bias的计算，如式（1）所示：

式中，为模型的预测值；yi为真实值；n为校正样本数。

整体平均偏差Bias值越小，模型的补偿效果越好，根据图8计算得到浊度补偿后光谱数据模型的Bias为0.056 μg/L，且真实值与预测值间的相对误差不超过0.1%，表明补偿模型可基本消除样品浊度的影响。

3.3 方法性能检验

3.3.1 线性范围、检测限和重现性

以人工海水空白为参比，测定0浓度为标准空白的荧光强度Ab，测定不同浓度样品荧光强度为Aw；以荧光强度变化值（Aw-Ab）为纵坐标，样品浓度为横坐标绘制标准曲线，测得氨氮浓度的线性范围为10～125 μg/L，R2=0.999 2；亚硝酸盐浓度的线性范围为5～600 μg/L，R2=0.999 7。根据检出限（DL）=3a/k，其中，a为空白测定标准偏差，k为工作曲线斜率，计算得到氨氮、亚硝酸盐的检测限分别为2.4 μg/L、1.2 μg/L。

为了确定方法的重现性，采用海水样品加标测试，进行5次重复测定，氨氮浓度为50 μg/L与100 μg/L的样品，相对标准偏差分别为5.4%和3.5%；亚硝酸盐浓度为80 μg/L的样品，日内相对标准偏差（RSD）为3.3%，日间RSD为4.8%，两者检测均具有较好的稳定性。

3.3.2 海水测定及方法比对

采集实际海水水样，分别使用原位监测仪和国标法，在实验室内进行静态水样的测定，测定结果如表2、表3所示，所建立的光纤系统（OPA法）对氨氮的测定结果与国标法进行比较，相对误差为-6.3%～6.6%；亚硝酸盐的测定结果与国标法测定的结果相差不大，相对误差最大不超过4.9%，表明在水体处于静态的情况下，所建立的光纤系统能够较准确地测定海水中氨氮和亚硝酸盐浓度。

表2 实验室内氨氮检测结果对比Table 2 Comparison of test results of ammonia nitrogen in laboratory

表3 实验室内亚硝酸盐检测结果对比Table 3 Comparison of test results of nitrite in laboratory

3.3.3 原位测定及方法比对

实验进一步评估了原位监测仪现场监测养殖海水中氨氮和亚硝酸盐浓度的准确性，在福建省海水鱼繁育基地养殖池（24°21′46′′N，118°02′57′′E）开展为期两周连续测定和比对试验。每天定时启动原位监测仪的同时，对同深度、同时刻采集的海水样品，采用GB 17378.4-2007方法分析测定氨氮和亚硝酸盐浓度，两者进行比对。如表4、表5所示，氨氮（浓度在6.0～83.5 μg/L范围内）的原位监测与实验室方法测定结果相对偏差范围在-16.9%～18.8%；亚硝酸盐（浓度在0.8～7.8 μg/L范围内）的原位监测与标准法测定结果相对偏差范围在-18.0%～15.0%，两者测定结果基本相符，相对误差在±18%区间内，较长时间内的监测结果具有较好的一致性；部分水样中氨氮和亚硝酸盐浓度较低，这部分水样浓度落在原位仪器检测定量限以下，这部分比对结果不能计算。结果表明，本法所提出的原位监测仪能够克服养殖海水中复杂环境参数对氨氮和亚硝酸盐测定结果的干扰，基于简便的光纤耦合微通道反应系统，分别实现海水中氨氮和亚硝酸盐较为准确的原位监测。

表4 现场水样氨氮原位监测结果对比Table 4 Comparison of in-situ monitoring results of ammonia nitrogen in field water samples

续表 5

表 5 亚硝酸盐原位检测结果对比Table 5 Comparison of in situ detection results of nitrite in field water samples

续表4

4 结论

本文基于光波长切割、光纤波导和注射式微通道反应—Z型池检测系统，制备了一种新的原位光谱分析光纤检测装置，仅需一套装置即可实现荧光和紫外可见光度法两种检测模式，分析简便、高效。海水pH变化对该系统原位监测结果的影响较小，温度、盐度和浊度对亚硝酸盐和氨氮测定结果则具有较大干扰。本法通过添加恒温装置来消除影响，实现了微通道反应系统的稳定性；通过光谱吸光度校正数学模型进行校正，消除了盐度和浊度所造成的不利影响。在最佳条件下，氨氮、亚硝酸盐的原位监测浓度线性范围分别为10～125 μg/L和5～600 μg/L，检出限分别为2.4 μg/L、1.2 μg/L；应用于养殖水中氨氮和亚硝酸盐的连续两周监测分析可知，仪器原位监测与标准方法的测定结果相符，相对偏差分别为-16.9%～18.8%，-18.0%～15.0%，较长时间内监测结果具有良好的一致性。本文所提出的技术在同一模块中可实现氨氮和亚硝酸盐的荧光和分光光度两种模式的原位监测，分析检测结果较为稳定和准确，可为海水中氨氮、亚硝酸盐的原位监测仪器更好的集成化设计和稳定的应用提供新技术。