湖南柑橘溃疡病菌的多态性鉴定及致病力分析

2023-01-12罗旭钊朱韬郝晨星朱亦赤马先锋邓子牛韩健

湖南农业大学学报（自然科学版） 2022年6期

罗旭钊，朱韬，郝晨星，朱亦赤，马先锋，邓子牛，韩健

罗旭钊1,2，朱韬1,2，郝晨星1,2，朱亦赤1,2，马先锋1,2，邓子牛1,2，韩健3*

(1.园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程中心，湖南长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南长沙 410128；3.湖南省园艺研究所，湖南长沙 410125)

采集湖南省6个柑橘产区的呈现典型溃疡病症状的柑橘叶片、枝条或果实样品26份，分离溃疡病菌株，采用柑橘溃疡病特异性引物鉴定、细菌保守的16S rDNA序列分析及重复序列PCR基因指纹分析(Rep–PCR)方法，分析具有地域代表性的12个菌株间基因组多态性。结果显示，12个菌株在BOX–PCR和ERIC–PCR中扩增出相同数量的多态性条带，无法通过Rep–PCR对菌株进行区分；串联重复位点多态性分析表明，CCB–2、CCB–3和CCB–10 这3个菌株在GT1位点上出现片段大小多态性；通过活体注射接种方式，将12个溃疡病菌株接种至冰糖橙叶片，结果CCB–2和CCB–4菌株表现出较稳定致病力，综合病情指数达到75%以上，表明CCB–2相比其他11个菌株可能在基因组序列水平存在多态性，且影响菌株的致病力水平。

柑橘；柑橘溃疡病；多态性；致病力；湖南

柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(subsp.)引起的柑橘毁灭性病害[1–2]，湖南、湖北、广东、广西、四川、重庆、江苏和浙江等产区时有发生。根据病原菌的寄主范围、致病症状、噬菌体分型、DNA指纹和地理分布的不同，柑橘溃疡病菌被分为A、B、C、D和E菌系[3]等5种细菌形式或病原体类型，其中A菌系是传播范围最广、侵染力最强的致病型[4]。目前已知的2种A菌系的变种A*和Aw，寄主范围仅限于墨西哥来檬()、塔西提来檬()和阿来檬()，可通过扩增片段长度多态性(AFLP)在亚属水平上进行区分[5]。B、C菌系被认为是A菌系的减毒类型[6]。由于细菌基因组中限制性内切酶的酶切位点分布是独特、稳定、可克隆遗传的，柑橘溃疡病菌株的限制性片段长度多态性(RFLP)可用来区分B、C、D菌系和A、E菌系[7]。

杨贵兵[8]对湘南、湘西、湘中、湘北共89个果园进行调查，发现多数果园全年未喷施溃疡病的防治药剂，各产区呈现不同的感病程度。感染柑橘溃疡病的果实症状在后期与柑橘疮痂病非常类似，容易混淆[9]，因此，对柑橘溃疡病田间症状观察鉴定的结果只能视作是初步结果，必须结合溃疡病菌系特异引物鉴定以及细菌16S测序才能对其进行判定。HARTUNG等[10]基于柑橘溃疡病菌H I限制性片段设计引物pFL1，用于常规PCR鉴定，能够扩增出溃疡病菌A菌系及其2个近缘种。王中康等[11]设计的特异性引物JYF5和JYR5，具备良好的特异性和灵敏度。胡春华[12]根据致病基因末端的3个核定位序列设计的P8/P9能够特异性检测柑橘溃疡病菌。

细菌基因组中广泛存在着高度保守的串联重复序列，Rep–PCR(REP)DNA指纹技术就是基于这些串联重复序列在不同菌株中的多态性来区分不同菌株[13]。CUBERO等[14]和GRAHAM等[15]利用ERIC–PCR发现A菌系可以扩增出375 bp的基因序列，该基因序列可用来区分A菌系和属的其他细菌；姚廷山等[16]同样通过Rep–PCR技术分析出9个省份的柑橘溃疡病菌具有丰富的多样性；李文婷等[17]通过比对分析8个柑橘溃疡病菌全基因组序列的串联重复位点(Short Tandem Repeat, STR)，筛选出6个高度变异位点，利用这些位点对广东省15个市(县)14个品种共352个柑橘溃疡病菌菌株进行遗传多样性分析，发现基于遗传多样性和遗传距离对广东省不同地区的柑橘溃疡病菌株鉴定出6组类群，且同一地理来源或地理来源相邻的菌株聚为一类，表明菌株的遗传变异与所处的环境以及气候条件存在一定的相关性。

湖南省不同柑橘产区感染柑橘溃疡病后表现出差异[18]。笔者对湖南6个柑橘产区枝、叶、果实的溃疡病菌进行分离和鉴定，利用Rep–PCR技术分析各菌株基因组中串联重复序列的多样性，并将柑橘溃疡病菌接种至活体的冰糖橙叶片上，比较各分离菌株致病力的强弱，以期为柑橘溃疡病的防治提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

分别于2019年6月和2020年9月从湖南省株洲市、娄底市、永州市、郴州市、怀化市和邵阳市等柑橘产区采集感染柑橘溃疡病的冰糖橙的枝条、叶片、果实样品共26份，其中株洲市、娄底市、邵阳市、怀化市各1份，永州市12份，郴州市10份。

XacDL–509和DL–509–GFP菌株由国家柑橘改良中心长沙分中心保存[19]；突变菌株Xcc049A由上海交通大学陈功友教授团队惠赠。

1.2　方法

1.2.1湖南柑橘溃疡病病原菌的分离与鉴定

采用稀释分离法[20]分离冰糖橙枝条、叶片和果实中的病原菌；以纯化后的菌液为模板，采用胡春华[12]设计的P8/P9和王中康等[11]设计的JYF5/JYR5柑橘溃疡病菌特异性引物(表1)对菌株进行溃疡病常规PCR鉴定；采用HARTUNG等[21]设计的pFL1引物对鉴定菌株是否属于A菌系。菌株16S rDNA的扩增采用WEISBURG等[22]设计的引物fD1/rP2，利用NCBI BLAST将16S rDNA扩增测序结果进行数据库检索与比对。

表1　试验所用引物信息

1.2.2湖南柑橘溃疡病菌株Rep–PCR及STR位点多态性分析

参照HARTUNG 等[21]的方法，采用BOX 1AR和ERIC1/ERIC2引物对鉴定出的溃疡病菌株的DNA进行多态性分析，并基于李文婷等[17]的研究，挑选遗传多态性较丰富的GT1、GT3位点引物对鉴定的菌株DNA进行多态性分析。

1.2.3湖南柑橘溃疡病菌株的致病力测定

将分离鉴定后的溃疡病菌株重新激活，挑选冰糖橙上即将达到最大叶面积且尚未转绿的嫩叶背面进行活体注射接种，每个菌株进行3次生物学重复，并以等浓度的黄单胞杆菌属的水稻白叶枯病原菌(pv.)作为非致病菌对照。接种后，观察记录第7、10、14、20和45天的症状；参照李建挥[23]采用病情指数的统计方法，在接种后第45天测量接种区域典型病斑(火山口状或愈伤状突起、周围有明显黄色晕圈)直径，不规则形状的病斑则取长径与短径的平均值，重复3次，根据病情指数比较菌株的致病力差异。

2　结果与分析

2.1　湖南柑橘溃疡病致病菌的鉴定结果

从湖南柑橘产区采集的感染溃疡病的冰糖橙病叶症状存在差异，采集自永州市的病叶上的单个病斑面积较大，病斑周围的黄绿色晕圈范围也较广(图1–1)；而采集自郴州市宜章县的病叶上单个病斑面积较小，黄绿色晕圈不明显(图1–2)；采集自邵阳市的病叶单个病斑木栓化程度较为严重(图1–3)。根据症状差异，挑选出12个菌株进行后续试验，分别命名为CCB–1、CCB–2、CCB–3、CCB–4、CCB–5、CCB–6、CCB–7、CCB–8、CCB–9、CCB–10、CCB–11以及CCB–12，其中CCB–1来源于株洲，CCB–2来源于娄底，CCB–3、CCB–5、CCB–6、CCB–7、CCB–8来源于郴州，CCB–9来源于邵阳，CCB–4、CCB–10、CCB–11、CCB–12来源于永州。对病斑周围的黄绿色晕圈进行组织分离，梯度稀释后，在LB固体培养基上分离培养，12个菌株与3个对照菌株相比，单菌落特征一致，在LB固体平板上生长速率也基本一致(图2)。

图1　湖南冰糖橙溃疡病叶片发病症状

　　　1～12　溃疡病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

以纯化后的菌液为模板进行PCR扩增，产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，各菌株扩增片段大小与引物P8/P9和JYF5/JYF5R预期目的片段大小相吻合，条带清晰完整，表明分离的菌株均为柑橘溃疡病菌(图3)。利用PFL1–2和PFL1–3引物对菌株进行菌系鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，12个菌株均为溃疡病A菌系(图4)。

A　P8/P9引物鉴定结果；B　JYF5/JYR5引物鉴定结果。

M　2000 bp Marker；1～12　溃疡病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

利用细菌16S rDNA通用引物fD1/rP2对分离的菌株和3个对照菌株进行PCR扩增，将扩增片段连接至改造的pYL–T克隆载体并测序，利用NCBI基因组数据库检索与各菌株16S rDNA序列相似性较高的细菌基因组序列，结果(图5)显示，分离的12个菌株的16S rDNA与柑橘溃疡病菌的16S rDNA均高度相似，表明分离的12个菌株均为柑橘溃疡病菌(表2)。

M　2000 bp Marker；1～12　溃疡病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

表2　湖南省柑橘溃疡病菌16S rDNA序列比对结果

2.2　基于Rep–PCR的湖南柑橘溃疡病菌株多态性

以12个菌株的菌液为模板分别进行Rep–PCR扩增，产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，BOX–PCR的扩增效率较高，共扩增出9条目的条带，片段大小集中于500～5000 bp(图6)，而ERIC–PCR的扩增效率较低，但分辨率更高，共扩增出7条目的条带，片段大小集中于750～5000 bp(图7)。Rep– PCR结果表明，各菌株之间没有明显的多态性。

M　5000 bp Marker；1～12　溃疡病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

利用已筛选到的2个具有高度多态性STR位点引物对12个溃疡病菌株进行多态性鉴定。GT1多态性位点验证结果显示，CCB–2、CCB–3、CCB–10在300 bp左右的位置出现片段大小多态性(图8–A)，而在GT3位点上未表现出多态性(图8–B)。

A　GT1引物扩增结果；B　GT3引物扩增结果；1～12　溃疡病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

2.3　湖南柑橘溃疡病致病菌菌株的致病力

接种20 d后，不同菌株致病的症状有差异。接种CCB–1的区域在第20天基本不表现症状(图9–1)，仅在局部区域形成少量的针孔大小的油渍状斑点，未形成典型的火山口病斑凸起，与缺失致病效应子的Xcc049A表现的症状类似，而接种其他菌株的区域均出现典型病斑(图9–2和图9–3)。此外，接种CCB–4的区域病斑数量较多，病斑形成的速率较快且症状稳定。通过统计各菌株接种区域病斑大小，计算病情指数，综合评价的结果显示CCB–2、CCB–4与CCB–13菌株致病力明显优于其他菌株(表3)。

图9　冰糖橙叶片活体注射接种溃疡病致病菌株后第20天症状

表3　冰糖橙叶片活体注射接种溃疡病致病菌株的病情指数

同列不同字母表示菌株间的差异有统计学意义(<0.05)。

3　讨论

湖南柑橘栽培历史悠久，品种资源丰富，但抗柑橘溃疡病的种质资源极其稀少，柑橘产区受溃疡病为害严重，已有65个县(市)发病，疫区县(市)占全省总县(市)的57.5%，甜橙和柚发病果园占43%[2]，且不同产区受害程度不同，推测不同产区对柑橘溃疡病的耐感性差异可能是由于菌系多态性导致。基于本研究中柑橘溃疡病特异性引物鉴定，湖南不同柑橘产区的柑橘溃疡病菌均为致病力最强的A菌系，且细菌保守的16S rDNA序列分析结果表明各产区柑橘溃疡病菌多态性较为单一，各产区感病程度的差异可能更多地与各地防治手段有关[18]。田间调查中观察到各柑橘产区不同柑橘品种感染溃疡病的症状不尽相同[24]。潘贞珍观察了‘滑皮金柑’‘建阳橘柚’和‘沃柑’3个品种的叶片结构，测定了叶片生化物质含量及其与柑橘溃疡病感病程度的相关性，发现这3个品种的叶片气孔密度与柑橘溃疡病感病程度呈极显著正相关，气孔面积与柑橘溃疡病感病程度呈显著正相关，叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、蜡质含量等与柑橘溃疡病感病程度均呈极显著负相关[25]，为不同柑橘品种对柑橘溃疡病的抗感性差异给出了初步解释。而笔者所收集的不同产区病叶虽为同一品种，但叶龄不一致，导致同一品种叶片结构发生变化，也可能导致发病症状的不同。

采集自湖南不同柑橘产区的冰糖橙溃疡病叶片症状有差异，通过叶片组织分离法获得的溃疡病菌单个菌落的特征一致，且采用柑橘溃疡病特异引物P8/P9和JYF5/JYF5R鉴定的结果表明这些叶片的症状均是由溃疡病菌引起，但冰糖橙叶片活体注射接种分离鉴定的菌株后，在叶片上形成的症状和病斑特征存在差异。这可能是由于来自不同产区的溃疡病菌系不同或者同一菌系的多态性有差异，导致各菌株的致病力不同，注射接种冰糖橙叶片后叶片表现的症状不同。徐磊[26]对不同产地的柑橘溃疡病菌株进行鉴定时发现，柑橘溃疡病菌存在严重的小种分化情况，且Eric–PCR的分辨率较Box–PCR更高，本试验结果与其研究结果一致。活体注射接种菌株至冰糖橙叶片，CCB–2、CCB–4引起的症状稳定，但CCB–2、CCB–3、CCB–10在GT1位点上表现出同样的多态性条带，可能表明STR位点上缺失或插入重复单元并不影响菌株致病力。

ABE等[27]研究发现，2个或2个以上基因的缺失比单个缺失更能显著降低柑橘溃疡病菌在植物中的生长繁殖，表明基因在柑橘溃疡病菌致病性和适应能力上具有叠加作用，这种叠加作用与感病基因中效应子结合原件(effector-binding elements)的核苷酸多态性有关。作为溃疡病菌的致病效应子，在溃疡病菌侵染植株形成典型病斑的过程中起到至关重要的作用[28]，且表达水平与柑橘溃疡病菌的致病力呈正相关[29]。从对照菌株Xcc049A(缺失菌株)的致病表型可以看出，溃疡病典型病斑的火山口症状依赖于的表达，而分离的湖南柑橘溃疡病致病菌株所致典型症状的差异是否与的表达水平以及序列差异相关，有待进一步验证。

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Polymorphism and pathogenicity analysis of citrus canker pathogens in Hunan

LUO Xuzhao1,2，ZHU Tao1,2，HAO Chenxing1,2，ZHU Yichi1,2，MA Xianfeng1,2，DENG Ziniu1,2，HAN Jian3*

(1.Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding, Changsha, Hunan 410128, China; 2.National Center for Citrus Improvement, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Hunan Horticultural Research Institute, Changsha, Hunan 410125, China)

Twenty-six citrus leaf, branch or fruit samples showing typical symptoms caused bysubsp.() were collected from six citrus producing areas in Hunan Province, and the citrus canker pathogen strains were isolated. Genomic polymorphisms among 12 geographically representative pathogen strains were analyzed by bacterial conserved 16S rDNA sequence analysis and repetitive sequence PCR gene fingerprinting (Rep-PCR) methods using citrus canker-specific primer. The results showed that the 12 strains showed the same number of polymorphic bands in BOX-PCR and ERIC-PCR and could not be distinguished by Rep-PCR, while tandem repeat polymorphism analysis showed that 3 strains, strain CCB-2, strain CCB-3 and strain CCB-10, showed fragment size polymorphism at the GT1 locus. Twelve strains of citrus canker were inoculated by in vivo injection into the leaves of ‘Bingtang’ sweet orange and two strains, strain CCB-2 and strain CCB-4, showed stable pathogenicity with a combined disease index of over 75%, indicating that strain CCB-2 may have polymorphism at the genomic sequence level compared to the other 11 strains and affect the pathogenicity level of the strain.

; citrus canker; polymorphism; pathogenicity; Hunan

S436.661+2

1007-1032(2022)06-0691-08

罗旭钊，朱韬，郝晨星，朱亦赤，马先锋，邓子牛，韩健．湖南柑橘溃疡病菌的多态性鉴定及致病力分析[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2022，48(6)：691–698．

LUO X Z，ZHU T，HAO C X，ZHU Y C，MA X F，DENG Z N，HAN J．Polymorphism and pathogenicity analysis of citrus canker pathogens in Hunan[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(6)：691–698．

http://xb.hunau.edu.cn