沙藏对白果蛋白质含量和氨基酸组成的影响

周梦怡，花彤彤，马小芳，孙海军，徐 莉

(1.南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037； 2.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；3.南京林业大学理学院，江苏 南京 210037)

白果是我国药食同源的典型代表。白果即银杏果实中可食用部分，其性味甘苦，营养丰富，含蛋白质、氨基酸、黄酮、核黄素、胡萝卜素、钙、磷、铁、钾等多种营养元素，并且具有多种食疗保健作用及药用价值。《本草纲目》中有记载，白果具有益肺气、治咳喘等功效。白果可以通过炒、炖、蒸等方式入菜，亦可加工成各类果脯、饮料、罐头等形式[1]。在我国及日本、韩国等东亚地区自古就有食用白果的习惯。我国是全球最大的白果生产国和出口国[2]。以邳州市为例，邳州市银杏种植面积3.3万hm2，白果年产量5000 t，各类银杏保健品800 t，出口至日本、韩国、美国和欧洲等地区[3]。通常，每年10月银杏果实成熟，采摘后经去皮、漂洗、漂白和风干等步骤后即可获得白果[4]。一为全年市场供应，二为来年播种，白果均需要进行储藏。在储藏过程中，白果的生命活动、重量、化学成分、营养价值均会悄无声息又不可避免地发生改变。分析现有文献可知，目前关于白果的研究集中在理化性质[5]、成分功能[6-7]和安全性[8-9]等方面，关于储藏期间营养成分变化的研究不足。碳水化合物、脂肪和蛋白质是食物三大宏量营养素。Ogushi等[10]研究了储藏期间白果碳水化合物和脂肪的变化。但尚无关于储藏对白果蛋白质影响的相关报道。白果的储藏方式主要有3种，常温储藏法(通风的室内)、冷冻贮藏法(恒温冷库，-1～4 ℃)、沙藏法[4]。沙藏法又称层积处理，即将植物种子埋入湿沙中存放于阴凉低温环境下。在沙藏过程中，白果会经历生理后熟而长出胚，种皮通透性增加，进而有利于来年萌发和播种[11]。本试验拟采用主成分分析和Pearson相关性分析方法来探讨沙藏过程中白果蛋白质含量和氨基酸组成的变化规律。

1 材料与方法

1.1 白果样品

供试材料采自江苏省邳州市陈楼镇银杏种质资源圃，共5个品种，编号1—5(表1)。手动去外种皮，水洗，室温风干，然后进行沙藏。于室内阴凉处，先在容器底部铺1层约10 cm厚的湿沙，然后铺上1层约10 cm厚的白果，再铺上1层10 cm厚的湿沙，以此类推，最后铺1层20 cm以上的湿沙作为顶层。

表1 所用白果信息描述

储藏期间随时检查，防止发霉变质。储藏满0、30、90、150 d后取出部分样品，手动去除中种皮、内种皮和胚乳，留种仁(即可食用部分)冻干(FD5型冷冻干燥仪，美国SIM公司)，磨成粉，存放于-20 ℃中待后续分析。

1.2 检测方法

1.2.1 粗蛋白含量的测定 称取样品5 mg左右(精确至0.001 mg)，包于锡纸中，2400Ⅱ型CHNS/O元素分析仪(美国Perkin-Elmer公司)，待空白试验、条件试验和乙酰苯胺校正后，进行样品分析。仪器得到的N元素含量数值乘以系数6.25，即为白果粗蛋白含量[12]，结果用g·kg-1样品干重表示。

1.2.2 氨基酸的提取及其组成的测定 称取样品500 mg左右(精确至0.1 mg)，置于水解管中进行盐酸水解，具体步骤见文献[13]。白果氨基酸的组成由S443D型全自动氨基酸分析仪(德国Sykam公司)进行检测。该仪器基于色谱柱分离、柱后衍生、在线检测的工作原理。样品中的氨基酸通过4.6 mm×150 mm阳离子分析柱(LCA K06/Na)进行捕获和分离，流动相为A/B/D(德国Sykam公司)梯度变化的混合液：0～11 min，0% B；11～17 min，15% B；17～23 min，20% B；23～27 min，33% B；27～30 min，80% B；30～42 min，100% B；42～45 min，100% D，流速0.45 mL·min-1，柱温57 ℃(0～27 min)和74 ℃(27 min—结束)。柱后衍生系统为茚三酮溶液(德国Sykam公司)，流速0.25 mL·min-1，反应温度130 ℃。在线检测器为UV-可见光检测器，570 nm和440 nm双波长同时检测。

采用外标法进行定量分析，标样为17种氨基酸混标(美国Agilent Technologies公司)，包括天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)，苏氨酸(Threonine，Thr)，丝氨酸(Serine，Ser)，谷氨酸(Glutamic acid，Glu)，脯氨酸(proline，Pro)，甘氨酸(Glycine，Gly)，丙氨酸(Alanine，Ala)，半胱氨酸(Cysteine，Cys)，缬氨酸(Valine，Val)，蛋氨酸(Methionine，Met)，异亮氨酸(Isoleucine，Ile)，亮氨酸(Leucine，Leu)，酪氨酸(Tyrosine，Tyr)，苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)，组氨酸(phenylalanine，His)，赖氨酸(Lysine，Lys)，精氨酸(Arginine，Arg)。样品中单个氨基酸含量的结果用mg·g-1干重表示。

1.3 数据处理

文中数据用均值(Mean)±标准误值(SE)表示。采用Origin 8软件绘制色谱图。采用SPSS 21软件进行数据统计分析，包括组间单因素方差分析(Tukey检验，以P<0.05为差异有统计学意义)、氨基酸浓度的变异系数(Coefficient of variation percentage，CV%)、氨基酸浓度变化和储藏时间之间的皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient，ρ)、以及以每个时间点各氨基酸含量为响应变量的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 结果与分析

2.1 沙藏过程中白果粗蛋白含量的变化

沙藏过程中各品种白果粗蛋白含量的变化见图1。从整体上看，白果粗蛋白含量随沙藏时间的增加呈现出波动式上升的趋势，由184.7 g·kg-1(0 d)增加至234.3 g·kg-1(150 d)，增加了26.84%。沙藏期间白果不可避免会遭受真菌污染，这些真菌一方面消耗碳水化合物导致白果干重降低，另一方面可以从环境中吸收有机氮和无机氮[14]，而白果粗蛋白的含量是基于其N元素含量的测定结果而换算得到。以上可以解释为什么在储藏期间白果粗蛋白含量表现为波动式上升。

图1 储藏期间白果粗蛋白的含量

就单个品种而言，其粗蛋白含量变化的趋势和幅度均存在品种差异。3号品种粗蛋白含量在储藏30 d后达到峰值，之后回落，趋于平稳，最高值(30 d)与最低值(0 d)之间差值为29.6 g·kg-1。同样地，4号、5号品种(均来自浙江省长兴林业局)的变化幅度分别为92.5、61.0 g·kg-1。而1号品种粗蛋白含量在90 d回落至最低值后又迅速攀升，在150 d到达峰值，最高值(150 d)与最低值(90 d)之间差值为74.4 g·kg-1。

2.2 沙藏过程中白果氨基酸组成的变化

图2为氨基酸分析仪对白果氨基酸组成进行定性和定量分析的色谱图。由图2可知，在本试验色谱条件下，氨基酸混合标样得到了较好的分离(图2 A)，同时白果样品的17个目标峰分离度良好，且保留时间与标样一致(图2 B)，证明色谱条件合适，可以进行后续的定性和定量分析。

图2 氨基酸混合标样(A)和白果样品(B)氨基酸色谱图

与粗蛋白含量变化不同，白果中总氨基酸(Total amino acids，TACs)的含量呈现波动式减少，整体上由84.36 mg·g-1(0 d)下降至75.60 mg·g-1(150 d)，减少了10.39%，较粗蛋白含量变化幅度小(图3)。就单个品种而言，1号品种波动最大，最大值(90 d)与最小值(150 d)之间差值为61.96 mg·g-1；4号品种波动最小，最大值(90 d)与最低值(30 d)之间差值为13.32 mg·g-1；5号品种居中，最大值(90 d)与最低值(0 d)之间差值为22.47 mg·g-1。

图3 储藏期间白果总氨基酸的含量

白果氨基酸组成见表2～表3。在储藏期间，各氨基酸的含量均发生了不同程度变化。在10个必需氨基酸中，只有Cys和Met的含量在经历150 d沙藏后增加了，分别增加315.30%和17.06%；而其余氨基酸中，除Lys在储藏30 d时达到最大值后回落外，其余均在90 d后达到最高值再快速下降，并低于初始含量(0 d)。为了评估各氨基酸含量在储藏期间的变化大小，计算了变异系数值(CV)。变异系数又称为离散系数，主要用于比较不同样本数据的离散程度，是统计学当中常用的一个统计指标[15]。由CV值可以看出，储藏时间对Cys含量的影响最为明显，表现为其CV数值最大，为54.55%；Met紧随其后(CV=33.95%)。值得注意的是，Cys和Met均属于含硫氨基酸，该类氨基酸很容易从人体内丢失[16]。Thr、Val、Leu、Phe和His的CV值均小于20%，说明其在储藏期间相对较稳定。在7个非必需氨基酸中，只有Ser在经历150 d储藏之后增加了6.06%，其余均在波动变化中减少。从整体上看，非必需氨基酸CV值均低于30%，提示非必需氨基酸受储藏的影响较必需氨基酸小。就储藏时间来看，除了Cys、Lys和Arg外，其余氨基酸浓度均在90 d时达到最高。

表2 储藏期间白果必需氨基酸的组成

表2(续)

2.3 白果各氨基酸含量与沙藏时间之间的相关性分析

为了更好地描述各氨基酸含量与储藏时间的关系，采用皮尔森相关性系数进行分析，结果见表4。皮尔森相关系数是一种简单的度量2个变量关系之间线性关系的统计量，其相关性系数r值介于-1～1之间，|r|越大说明相关性越强[17]。由表4可知，大部分氨基酸的含量均与储藏时间表现出负相关性，意味着随着储藏时间的增加其含量降低。该结果与表2、表3一致。值得注意的是，5个品种的Cys含量与储藏时间呈极显著的正相关(0.798，P<0.01)，表明Cys含量可能是判断沙藏时间的一种潜在指标。

表3 储藏期间白果非必需氨基酸的组成

表4 白果内各氨基酸含量与储藏时间的皮尔森相关性

2.4 白果氨基酸成分主成分分析

为进一步分析储藏过程中白果各氨基酸含量的响应变化规律，对5个品种、各取样时间点的每个氨基酸含量及TCA含量的数据进行主成分分析(Principal component analysis，PCA)。PCA分析一种标准的降维方法，可以将大量变量转化为几个综合指标[18]。根据PCA降维思想，将储藏期TCA和17种氨基酸的含量划分为若干主成分，提取到3个主成分(PC1、PC2和PC3)，累积贡献率为85.307%(图4)。

●为1号品种白果；◆为2号品种白果；▲为3号品种白果；-为4号品种白果；■为5号品种白果 图4 主成分分析得分图

Cys(-0.946)和Thr(0.812)是PC3最重要的判别变量，从图4可以看出，0 d和150 d分别集中在上方和下方，30 d和90 d集中在中部，说明在整个储藏期间，Cys含量在增加，Thr含量在减少，与表2相符。Met(0.946)、His(0.839)、Pro(0.838)和Asp(0.734)是PC2最重要的判别变量，在PCA2这个维度上，30 d集中在左侧，90 d集中在右侧，说明这4种氨基酸总含量在30 d时最低，90 d时最高。这个规律与TACs变化规律一致，提示该4个氨基酸总量的变化可以反映TACs的变化趋势。其余大部分的氨基酸属于PC1，居前3位的为Lys(0.856)、Arg(0.833)和Phe(0.808)；在这个维度上，不能将时间这个变量区分出来，但是不同品种表现出了差异：1号品种最分散，2号和4号则相对较集中，提示储藏过程中1号品种受到的影响最大，2号和4号较小。

3 结论

本试验选取5个品种的白果，连续沙藏150 d，考察沙藏对其蛋白质含量和氨基酸组成的影响。结果显示，随着沙藏时间的增加，白果粗蛋白含量呈现出上升的趋势；而总氨基酸含量则表现为下降；就单个氨基酸而言，大部分的氨基酸含量均表现出在波动中显著下降趋势(P<0.05)，而Met和Ser的含量则在波动变化中增加了。更特别的是Cys，其含量随储藏时间增加而增加，并表现出极显著正相关性(ρ=0.798**，P<0.01)，提示该氨基酸含量具有作为检查白果沙藏时间或预测其品质的一种指标的潜能。基于PCA分析结果得知，2号(叶籽银杏)和4号(长兴1号)这2个品种的白果蛋白含量和氨基酸组成在沙藏期间变化相对较小，提示沙藏对这2个品种影响小。以上试验结果表明，沙藏显著改变了白果蛋白质类营养物质，且该影响具有品种特异性，对未来白果品种的筛选具有参考价值。在接下来的试验中，将开展更大规模的品种比较。