气相色谱法测定乙基纤维素中乙醛的含量及其不确定度评定

屠哲玮，唐倩倩，金伟斌，顾晓风*

1 苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215104；2 山东绿叶制药有限公司，烟台 264670

测量不确定度是与测量结果相关联的参数，也是显示测量结果质量的重要指标，用于评价结果的可信赖程度。当测量结果出现临界值或对建立的非标准方法进行验证时，不确定度评定即具有重要意义[1]。《中国药品检验标准操作规范》（2019版）[2]介绍了通过pH测定法、非水溶液滴定法等检验方法测量不确定度评定的实例。同时，相关文献报道表明[3-5]，测量不确定度评定广泛应用于药物制剂、原料药等领域 。

乙基纤维素（ethyl cellulose）是一种纤维素的醚化衍生物，因其良好的成膜性和水不溶性，是制备药物缓控释制剂最重要的辅料之一，也是一种能够有效延缓亲水性药物释放的重要膜控材料[6-7]。乙基纤维素作为药用辅料首次收载于《中国药典》（2000版），现行为《中国药典》（2020版）[8]。采用甲基苯并噻唑酮腙盐酸盐溶液对乙醛进行衍生化后，通过标准比色法来控制其含量，方法操作复杂，专属性不强，且无法体现待测样品中乙醛残留量的相关数据，不利于评价工艺控制水平。自2010年版《中国药典》起，特别强调辅料的安全性评估。药用辅料作为制剂的重要组成部分，直接影响着药物制剂的安全性[9]。因此，建立一种专属准确的乙基纤维素中乙醛的含量测定方法，有利于控制乙基纤维素中的乙醛杂质，以更好地保障乙基纤维素及药物制剂的安全性。

相关文献报道[10-14]，乙醛定量测定的方法有气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法等。离子色谱法由于仪器昂贵，普及性不如气相色谱法和液相色谱法。由于乙醛的结构中缺少发色基团，在进行液相色谱法（紫外检测器）测定时，需借助衍生化试剂，操作复杂且衍生化效率可直接影响测定结果。顶空气相色谱法是将样品中的挥发性组分直接导入气相色谱仪进行分离和检测，无需前处理，受样品基质干扰小，故本研究选择顶空气相色谱法测定药用辅料乙基纤维素中乙醛的含量，并根据《测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1-2012》[15]以及其他不确定度评定方法[3，16-18]，对测量结果进行不确定度评定。本文通过建立数学模型，系统分析了不确定度的来源，并对各个分量进行评估和合成，以获得影响测量结果准确性的因素。

1 材料

1.1 药品与试剂

乙基纤维素（国药集团化学试剂有限公司，批号20140409）；乙醛（中国食品药品检定研究院，批号190159-201802，纯度99.3%）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号20180509，分析纯）；实验用水为纯化水。

1.2 主要仪器

7890B气相色谱仪（美国安捷伦公司，Agilent Open Lab Acquisition 2.4工作站，配置安捷伦7697A顶空进样器）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Milli-Q纯水仪（密理博公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：HP-INNOWAX石英毛细管柱（30m×0.32mm，0.5μm）；程序升温：起始温度为40℃，保持5min，以10℃/min的速率升至200℃，保持5min；进样口温度：200℃；分流比：10∶1；检测器：氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）温度250℃；载气：高纯氦气，流速1.0ml/min；顶空进样平衡温度：80℃，平衡时间：30min，进样时间：1min。

2.2 溶液配制

对照品溶液：精密称定乙醛100mg，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取上述乙醛溶液10ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取储备液5ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液5ml，置于20ml顶空瓶中，加入氯化钠1g，加盖密封，轻轻振摇3min，即得。

样品溶液：精密称定乙基纤维素0.25g，置于20ml顶空瓶中，加入氯化钠1g，精密量取水5ml加入顶空瓶中，加盖密封，轻轻振摇3min，即得。

空白溶液：取氯化钠1g，置于20ml顶空瓶中，精密量取水5ml加入20ml顶空瓶中，加盖密封，轻轻振摇3min，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性考察

按照“2.2”项下制备空白溶液、对照品溶液和样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别测定并记录色谱图，结果见图1。乙醛峰与相邻杂峰完全分离，空白溶液和样品溶液中的其他杂峰对乙醛的测定无干扰。

图1 气相色谱图

2.3.2 精密度考察

按照“2.2”项下方法制备对照品溶液6份，连续进样并记录乙醛峰面积。结果提示相对标准偏差（relative standard deviation, RSD） 为 1.84%，提示仪器进样精密度良好。

2.3.3 重复性考察

按照“2.2”项下方法平行配制6份样品溶液，进样后记录色谱图，按外标法计算乙醛的含量。见表1。

表1 重复性考察结果 n=6

2.3.4 线性关系考察

按照“2.2”项下方法，精密量取10、5、1、0.5ml和0.2ml对照品储备液，分别置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线系列溶液。按对照品溶液配制方法，进样测定，以乙醛质量浓度x（μg/ml）为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=8.7866x-0.0684，相关系数（r）为0.9992，表明乙醛在0.24～12.05 μ g/ml范围内线性关系良好。

2.3.5 定量限和检测限

按照“2.2”项下方法，配制乙醛对照品溶液，逐级稀释，测定并记录峰面积。定量限（limit of quantitation，LOQ） 为 0.24μg/ml（ 信 噪 比约为10∶1）；检测限（limit of detection，LOD）为0.12μg/ml（信噪比约为 3∶1）。

2.3.6 加标回收率

取乙基纤维素0.12g，精密称定，置于20ml顶空瓶中，加入氯化钠1g，平行制备9份，分为低、中、高3组，每组3份；分别精密加入乙醛对照品溶液1.5、2.5ml和3.5ml，再依次加入水3.5、2.5ml和1.5ml，加盖密封，轻轻振摇3min，进样测定，以外标法计算。见表2。

表2 加标回收率试验结果 n=9

2.4 测量不确定度评定

2.4.1 数学模型的建立

本研究采用外标法计算乙基纤维素中乙醛的含量，计算公式如下：

ms（mg）：对照品的称样量；Cs%：对照品的百分含量，99.3%；msample（mg）：样品的称样量；Asample：样品中乙醛的峰面积；Vsample：样品的稀释倍数；As：对照品中乙醛的峰面积；Vs：对照品的稀释倍数。

2.4.2 不确定度的来源分析

根据实验操作步骤和数学模型，得到气相色谱法测定乙基纤维素中乙醛含量的不确定度来源因果图，见图2。

图2 不确定度分量来源因果图

2.4.2.1 对照品制备引入的不确定度

使用XS205DU电子天平（万分之一天平）称量对照品，最大允许误差为±0.5mg，服从矩形分布，取，则对照品称量引入的标准不确定度为，相对标准不确定度为。

对照品的稀释过程使用100ml量瓶3次，10ml移液管1次，5ml移液管2次。根据《常用玻璃量器：JJG196-2006 》[19]规定，20℃时，100ml A级量瓶的容量允许误差为±0.10ml，概率分布按矩形分布，取，则100ml量瓶允许误差引起的不确定度分量为定容在（20±5）℃进行，已知水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，则体积变化为100×2.1×10-4×5=0.105ml。按均匀分布考虑，取，则温度引起的不确定度分量为因此100ml量瓶产生的标准不确定度为，其相对标准不确定度为。

以此类推，10ml移液管允许误差为±0.02ml，产生的标准不确定度为，则相对标准不确定度为而5ml移液管允许误差为±0.015ml，标准不确定度为则相对标准不确定度为。

2.4.2.2 样品制备引入的不确定度

按照“2.2”项下制备样品溶液，使用万分之一天平称量样品250mg，，相对标准不确定度为稀释过程中使用5ml移液管的相对标准不确定度为urel（V5）=0.001 835。因此样品制备引入的相对标准不确定度为

2.4.2.3 气相色谱仪引入的不确定度

气相色谱仪器的进样精密度会对每次测量结果的准确性产生影响，因此校正因子测定时引入的不确定度应考虑在内。在“2.3.2”项下经过考察仪器的进样精密度，得到乙醛峰面积分别为50.2575、49.7476、49.3569、49.6157、51.9914 和 50.1451，计算平均值为50.1857，标准偏差为0.9456，因此气相色谱仪测量引入的相对标准不确定度为

2.4.2.4 重复性测定引入的不确定度

在“2.3.3”项下考察了样品测定的重复性，6次样品测定得到乙基纤维素中乙醛含量的平均值为，标准偏差为S=0.000 0974，则相对标准不确定度

2.4.3 合成相对标准不确定度

在“2.4.2”项下各分量的不确定度来源彼此独立不相关，合成各相对标准不确定度分量，其中，由重复性测定贡献了最大不确定度分量为0.013 25。

综上，则采用气相色谱法测定乙基纤维素中乙醛含量的相对标准不确定度：

合成标准不确定度为u=0.0161×0.003=0.000 048%。取扩展因子k=2，则扩展不确定度为U=0.000 048×2=0.0001%。乙基纤维素中乙醛含量的结果：乙醛 %=（0.003±0.0001）%，k=2。

3 讨论

本研究前期通过考察HP-5（30m×0.32mm，0.25μm）、HP-INNOWAX（30m×0.32mm，0.5μm）、DB-WAX（30m×0.32mm，0.5μm）3种色谱柱发现，HP-5无法分离乙醛和相邻杂峰，DB-WAX峰形矮胖且灵敏度差，而HPINNOWAX获得的乙醛色谱峰峰形最为对称且尖锐，故选择HP-INNOWAX色谱柱用于本实验方法。

由于样品中其他杂峰较多，当起始温度为50℃时，乙醛峰无法与相邻杂峰完全分离；当起始柱温为40℃时，目标峰在5min内流出色谱柱。考虑到其他高沸点杂质，本实验方法选用5min后采用程序升温，使其他杂峰流出色谱系统，避免对连续进样造成干扰。

取70℃、80℃、20min、30min交叉组合进样，考察顶空进样的时间和温度。结果表明在80℃条件下平衡30min得到的乙醛峰面积最大。为提高分析灵敏度，在水样顶空处理过程中加入适量无机盐，对不加氯化钠、加氯化钠1g、加氯化钠2g 3种条件进行比较。结果表明，加氯化钠后，乙醛峰明显增高，而加氯化钠1g和2g并无明显差异，故本实验方法选择加氯化钠1g。

4 结语

本文通过建立气相色谱测定乙基纤维素中乙醛含量的方法，完善了现行质量标准。方法操作简单，数据科学、准确。对测定结果进行了不确定度评定，结果显示，重复性测定为最主要分量。提示实验中应规范操作，尽量减小人员带来的随机误差。