一测多评法测定首荟通便胶囊中4种大黄素类成份含量

马云，韩振明，马健，张微，关永霞，张贵民

1鲁南厚普制药有限公司，临沂 276006；2中药制药共性技术国家重点实验室，临沂 276006；3鲁南制药集团股份有限公司，临沂 276006

首荟通便胶囊由何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实共8味中药组成，可养阴益气、泻浊通便，临床上主要用于治疗功能性便秘及中医辨证属气阴两虚兼毒邪内蕴证者，可全面改善胃肠功能，适合老年人和体质虚弱者服用[1-2]。现代研究表明，首荟通便胶囊中的8种药材均具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多重药理活性[3-5]。其中，何首乌目前已知分离出100多种成份，如大黄酚、大黄素等。大黄酚能有效促进肠道运动，防止便秘；芦荟中所含芦荟苷、芦荟大黄素等活性成份具有通便、抗炎、抗病毒、抗菌、保护肝脏和神经等药理活性；决明子中含有大黄素、大黄酸、大黄酚、橙黄决明素、决明子苷等，具有降血脂的生物活性；枸杞子主要含枸杞多糖、甜菜碱、枸杞色素，枸杞多糖是一种水溶性多糖，是枸杞中最主要的活性成份，能促进免疫、抗衰老、抗肿瘤、清除自由基、抗疲劳、抗辐射、保肝；阿胶富含丰富的蛋白质，如赖氨酸、苏氨酸、明胶、精氨酸、组氨酸以及微量元素，在抗肿瘤、促进骨愈合以及促进造血功能等方面均有明显效果；人参主要活性成份有人参皂苷和多糖，对中枢神经系统、循环系统、内分泌系统等均有调节作用；白术主要化学成份有挥发油、多糖、内酯类等，如白术内酯、白术多糖、苷类、氨基酸等，具有抗肿瘤、抗炎、调节消化系统等药理作用；枳实中同样已分离出多种化学成份，如黄酮苷类、生物碱、挥发油等，具有调节消化系统、保护胃肠道、降脂、保护心血管、抗癌、免疫调节的药理作用。8味中药的多种活性成份可在临床治疗中达到协同作用[6-7]。

首荟通便胶囊的现行检测标准主要以薄层色谱法鉴别制剂中人参、枳实、芦荟、阿胶4种药材，同时采用HPLC法测定制剂中何首乌的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、枳实的柚皮苷含量。多指标多成份同时测定已成为综合评价中药处方制剂质量的主要研究方向，但活性成份标准对照品的消耗一定程度上限制了其发展。一测多评法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）可以某一种对照品为内标参照物，实现多种成份同步测定，目前已应用于多种中药材、中药制剂的品质评价[8-9]。基于此，本研究拟建立以大黄酚为内标参照物的QAMS，并对首荟通便胶囊中活性成份的含量进行测定，以优化首荟通便胶囊处方制剂的质量检测方法，达到降本增效的目的。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（包括DAD检测器、四元低压梯度泵、AgilentOpen Lab色谱工作站，安捷伦科技有限公司）；Waters高效液相色谱仪（包括e2695四元泵、2998二极管阵列检测器、自动进样器，美国Waters公司）；LE204E电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；01193-YP601N电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

芦荟苷A（aloin A，批号：110787，纯度≥98%）、芦荟苷B（aloin B，批号：110788，纯度≥98%）、芦荟大黄素（aloe emodin，批号：110775，纯度≥97%）、大黄酚（chrysophanol，批号：110796，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购自赛默飞世尔科技有限公司；异丙醇（色谱纯）、磷酸（色谱纯）均购自南京化学试剂股份有限公司；甲醇（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；有机滤头（孔径0.22μm，爱西默科技有限公司）；纯水。实验用14批首荟通便胶囊样品由鲁南厚普制药有限公司提供，样品信息见表1。

表1 首荟通便胶囊样品信息表

续表

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液的制备

取首荟通便胶囊内容物适量，研细，取样品粉末0.5g，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50ml，密塞，称重，超声处理（功率250W，频率100Hz）60min，放冷至室温，再次称重，用50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，静置，吸取上清液，0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚对照品各适量，用50%甲醇溶解并制成浓度分别为0.8010、2.9365、0.1760、0.0880mg/ml的对照品储备溶液，备用。取上述对照品储备液适量，以50%甲醇稀释，制成每1ml含芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚分别为0.0801、0.5873、0.0176、0.0088mg/ml的混合对照品溶液。

2.2 色谱条件

Agilent ZORBAX XDB C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱（见表2）；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为5μl；检测波长为220nm。理论板数按大黄酚计算不得低于5000。色谱图见图1。

表2 洗脱梯度

图1 对照品（A）和供试品（B）的HPLC图

2.3 线性关系

分别取上述混合对照品溶液不同体积，按照“2.2”项下色谱条件测定，以进样浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果表明芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚4种成份在各自范围内线性关系良好。见表3。

表3 4种活性成份线性关系

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次，记录峰面积并分析。结果芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚的平均峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取样品（批号：200101）粉末6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，以“2.2”项下的色谱条件测定峰面积，结果见表4。各组份RSD均小于2.5%，表明该方法重复性良好。

表4 4种活性成份重复性试验含量测定结果

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2.6 稳定性试验

取样品（批号：200101）0.5g，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、48h进样，测得芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚峰面积的RSD均小于2.0%，表明样品溶液在48h内稳定性良好，详见表5。

表5 4种活性成份稳定性试验峰面积测定结果

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2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品粉末6份，分别准确加入含有等量各组份对照品的对照品储备液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样测定，结果各组份回收率的RSD均小于4.0%，详见表6。

表6 4种活性成份加样回收率试验

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2.8 相对校正因子与相对保留值的确定

2.8.1 相对校正因子（fk/s）的计算

采用多点校正法，以多个质量浓度点计算所得平均值为fk/s。校正因子计算公式为fk/s=（As×Ck）/（Ak×Cs）（公式1）；待测成份质量浓度计算公式为Ck’=（fk/s×Cs×Ak’）/As（公式 2）。式中As为内标参照物色谱峰峰面积，Cs为内标参照物的质量浓度，Ak为待测组份色谱峰峰面积，Ck为待测组份的质量浓度。详见表7。

表7 多点校正法计算各成份相对校正因子

2.8.2 相对保留值的计算

以大黄酚色谱峰的保留时间为参照，计算各待测组份的相对保留值（relative reserved time，RRT），计算公式为RRT=Tk/Ts（公式3），式中Ts为内标参照物保留时间，Tk为待测组份保留时间，结果见表8。

表8 多点校正法计算各成份相对保留值

2.8.3 耐用性评价

本实验考察了不同色谱系统、色谱柱、试验时间、操作人员对fk/s与RRT的影响，结果见表9和表10。由表可知，不同考察条件下各活性成份fk/s的RSD均小于3.0%，相对保留值的RSD均小于5.0%，表明在试验所考察的各因素范围内均可准确测定各成份的含量。

表9 相对校正因子的耐用性试验

表10 相对保留值的耐用性试验

2.9 样品含量测定

2.9.1 QAMS与外标法（external standard method，ESM）测定含量的结果比较

取14批首荟通便胶囊内容物供试样品，按“2.1.1”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，分别通过QAMS、ESM进行含量计算，并对结果进行比较，详见表11。结果表明，不同计算方法得到4种活性成份含量的RSD均小于3%。

表11 样品含量测定结果 mg/g

2.9.2 多点校正理论保留时间与ESM法实际保留时间比较

将14批首荟通便胶囊供试品通过多点校正因子计算的理论保留时间与ESM的实际保留时间进行比较，结果无显著差异，见表12。

表12 4种成份的理论保留时间与实际保留时间比较 min

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3 讨论

本实验分别考察了提取溶剂（70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇）、称样量（0.25、0.50、1.00g）、溶剂体积（25、50、100ml）以及超声处理时间（30、60、90min）对样品含量的影响。结果表明，当提取方法为称样量0.50g、溶剂体积50ml、50%甲醇提取、超声处理60min时，样品色谱图峰面积适中，因此确定该条件作为本实验的样品提取方法。

本实验测定了首荟通便胶囊中4种活性成份的含量，其中芦荟苷A与芦荟苷B是同分异构体，可相互转化，且一定条件下均可氧化分解生成芦荟大黄素以及其他成份，在现有检测方法中，芦荟苷A与芦荟苷B均以芦荟苷计，且实际检测中常存在分离度低的情况，影响色谱峰峰面积的准确计算[10]。基于此，本实验考察了流动相中有机相的比例、pH及洗脱梯度等，最终以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时芦荟苷A与芦荟苷B的分离度最好。

本研究基于HPLC建立了以大黄酚为内标参照物的QAMS定量分析方法，可用于首荟通便胶囊的质量评价。以大黄酚为对照，首荟通便胶囊内容物中3种活性成份的相对fk/s分别为3.65、4.29、0.77，RRT分别为0.83、0.86、0.97。14批供试品中，ESM与QAMS的含量计算结果无统计学差异，表明QAMS测定结果可靠。本研究所建立的QAMS具有稳定、准确、简单、快捷、成本低等特点，可较全面地反映首荟通便胶囊的内在质量，且检测成本和检测时间均大幅降低。该方法可用于首荟通便胶囊的质量评价，也为其他中药处方制剂的质量控制提供了一定参考，有利于提高中药处方制剂的质量控制水平。