甘蔗ScPR10基因的克隆及其响应赤条病菌侵染的表达特征分析

李 娟 周敬如 储 娜 孙会东 黄美婷 傅华英 高三基

甘蔗基因的克隆及其响应赤条病菌侵染的表达特征分析

李 娟 周敬如 储 娜 孙会东 黄美婷 傅华英 高三基*

福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心, 福建福州 350002

PR10是一种病程相关蛋白(pathogenesis-related protein, PR), 在植物生长发育、应激生物和非生物胁迫时发挥重要作用。本研究利用RT-PCR技术从甘蔗赤条病抗病品种新台糖22号和感病品种闽糖11-610叶片克隆获得基因, 并利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)、转录组和蛋白质组分析, 研究在接种燕麦食酸菌燕麦亚种(subsp.,)之后这2个品种基因的转录和蛋白表达模式。序列分析显示, 本研究克隆获得2个基因, 编码187个氨基酸, 比其他植物PR10蛋白多了27个氨基酸, 含有保守结构域P-loop和Bet v 1; 与已报道的甘蔗、高粱和斑茅的PR10亲缘关系较近。在胁迫下, RT-qPCR分析表明抗病、感病品种基因的表达量均显著上调, 尤其在接种24 h时, 表达量最高, 分别为对照的27.2倍和39.7倍; 转录组数据分析结果显示, 该基因表达水平在抗病、感病品种上均显著提高, 尤其在接种72 h时, 表达量最高, log2FC值为5.3～5.4。蛋白互作预测发现, ScPR10与植物PDR型ABCG转运蛋白(Cluster-13677.282407)、蛋白激酶(Cluster- 13677.166559)之间存在互作关系。蛋白质组数据分析显示, 在接种24 h时, 抗病、感病品种ScPR10均为上调表达, log2FC值为1.65～1.69; 与ScPR10互作的PDR型ABCG转运蛋白成员的表达量在抗病、感病品种上有不同程度提高; 蛋白激酶表达量在感病品种上有显著提高, 但是, 在抗病品种上表达量没有显著变化。本研究结果表明, ScPR10可能与PDR型ABCG转运蛋白正向协同参与甘蔗寄主应答病菌侵染的防御响应。

PR10蛋白; 燕麦食酸菌燕麦亚种; 生物胁迫; 基因表达; 甘蔗

甘蔗spp. hybrids是全球重要的糖料和生物能源工业原料, 分别占全球食糖和乙醇产量的80%和40%[1]。甘蔗也是我国重要的糖料作物, 甘蔗糖约占我国食糖总量的86%[2]。甘蔗生长过程常遭受各种病原微生物的侵染, 其中燕麦食酸菌燕麦亚种subsp.()是引起甘蔗赤条病的病原, 属于燕麦食酸菌属[3-4]。除甘蔗宿根矮化病、白条病之外, 甘蔗赤条病是甘蔗三大细菌性病害之一, 在全球许多种植甘蔗的国家或地区普遍发生[5-6]。该病害造成阿根廷甘蔗经济损失达30%[7], 在我国各主要蔗区也普遍发生, 引起甘蔗显著减产、糖分下降[6-8]。挖掘甘蔗抗赤条病基因和解析其作用分子机制是甘蔗赤条病绿色防控亟待解决的关键科学问题。

植物受病原体感染或一些特定化合物处理后, 通常会产生一种病程相关蛋白(pathogenesis-related protein, PR), 与植物的抗病性密切相关[9]。此外, 植物PRs也会响应外界非生物胁迫刺激和植株开花、衰老等生命过程[10-11]。根据PRs的蛋白氨基酸序列和生物学功能, 将它们划分为17～19个基因家族[12], 其中PR10蛋白于1988年首次在欧芹细胞中分离鉴定, 在单、双子叶植物中普遍存在, 是在所有PRs中最大的家族基因[11-13]。PR10基因家族编码的蛋白是具有低分子量(5～19 kD)、微酸性、无信号肽等特征的蛋白[14]。PR10蛋白包含一个高度保守的Bet v 1结构域和一个磷酸结合环基序GXGGXG, 称为“P-loop”, 参与核糖核酸酶体外活性[14-15]。PR10蛋白在植物防御反应中起到重要的作用[16-17]。Xie等[18]在拟南芥中过表达玉米和基因, 用丁香假单胞菌番茄变种pv. tomato DC3000菌株接种转基因拟南芥叶片, 研究结果发现这2个基因提高了转拟南芥植株的抗病性。He等[19]将中国野生型葡萄的基因转入对霜霉病感病的欧洲葡萄, 转基因植株表现出对葡萄霜霉菌的抗性明显增强。

在甘蔗上, 有研究表明甘蔗植株受到褐锈病菌、黑穗病菌、高粱花叶病毒Sorghum mosaic virus侵染后基因明显上调表达, 说明该基因在病原微生物胁迫下的防御反应起正向调控作用[20-22]。最近, 我们课题组基于蛋白质组水平研究发现甘蔗基因正向调控寄主对侵染的防御反应[23]。虽然甘蔗PRs蛋白响应病原菌胁迫的表达特性已有一些报道, 但是, 关于甘蔗基因响应侵染的转录表达特性以及可能存在的互作蛋白未见详细报道。本研究拟从甘蔗赤条病抗病品种新台糖22号和感病品种闽糖11-610中分别克隆获得基因序列, 利用生物信息学比较它们之间的序列差异, 并分析这2个基因响应侵染的表达模式, 为进一步解析甘蔗基因抗病性分子机制奠定基础, 也为甘蔗抗病分子育种提供重要的基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

供试材料为新台糖22号和闽糖11-610, 分别是甘蔗赤条病抗病和感病品种, 保育于福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心。人工接种所用病菌SC-026菌株由本课题组保存, 是从甘蔗赤条病叶片样品上分离纯化获得[4]。本试验采用针刺接种法, 将SC-026菌株菌液配成108CFU mL–1的细菌悬浮液, 接种于处理组甘蔗叶片伤口处, 以无菌水接种作为空白对照。接种后采取套袋保湿的方法放入人工光照培养箱进行培养, 培养条件为30℃, 光照16 h, 湿度为85%。分别于接种后的0、24、48、72 h采集叶片样品, 用无菌剪刀在离伤口1 cm处剪15 cm左右的叶片, 用锡箔纸保存, 并立即放入液氮中固定, 于–80℃进行保存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA的合成

根据美国Invitrogen公司提供的RNA提取试剂说明书提取甘蔗叶片总RNA, 采用TRIzol法完成。分别用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量多功能酶标仪检测RNA的质量和浓度, 合格后, –20℃保存备用。参考中国大连TaKaRa公司逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一条链, 其中取新台糖22号、闽糖 11-610叶片总RNA 1.0 μL为模板, 反转录引物为Oligo dT。

1.3 甘蔗ScPR10基因的克隆

基于本课题组前期获得甘蔗转录组数据库(PRJNA579959)里的基因unigene序列[24], 利用Primer 5.0软件设计特异引物PR10-cDNAF: 5¢-ATGGCAACACAAGCAGAAGC-3¢和PR10-cDNAR:5¢-ATACACATACACCGCACACT-3¢。以新台糖22号、闽糖11-610叶片总RNA逆转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系包含1.0 μL cDNA、0.125 μL TaKaRa Ex酶(5 U μL–1)、2.5 μL 10× ExPCR buffer II (Mg2+plus)、2.0 μL dNTPs混合物(2.5 mmol L–1)、1.0 μL上游/下游引物(10 μmol L–1)和17.375 μL无菌水。PCR的反应程序为94℃预变性3 min; 94℃变性45 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸80 s,共35个循环; 72℃再延伸10 min。将PCR产物切胶回收纯化后连接至pMD19-T克隆载体, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 随机挑取5个单菌落进行菌液PCR鉴定, 将阳性克隆子送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

1.4 甘蔗ScPR10基因序列分析

利用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)在线软件分析基因的开放阅读框(open reading frame, ORF); 利用在线软件ExPASy中的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、SOPMA在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISSMODEL在线软件(https://swissmodel.expasy.org/)分别对ScPR10蛋白的一级结构、二级结构和三级结构进行分析; 同时, 应用NCBI保守结构域搜索(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测ScPR10蛋白结构域。从NCBI数据库下载不同物种基因编码的氨基酸同源序列, 连同本研究克隆得到的2个甘蔗品种ScPR10蛋白序列, 利用ClustalW软件进行序列比对分析, 并运用MEGA 7软件构建邻位相连法(Neighbor-Joining, NJ)的系统进化树; 分别用BioEdit软件和SDTv1.2软件进行氨基酸一致性分析及矩阵图绘制。利用StringDB蛋白质互作数据库(https://string-db.org/)对ScPR10互作蛋白进行预测和分析, 并应用Cytoscape软件构建蛋白互作网络图。

1.5 实时荧光定量PCR分析

应用Primer 5.0软件设计实时荧光定量PCR分析(RT-qPCR)检测引物PR10-QF: 5¢-AACACAAGCA GAAGCTGCAA-3¢和PR10-QR: 5¢-CGGAGGCCAT TACTTCAGTG-3¢。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)为内参基因进行校正, 利用SYBR Green染料法进行RT-qPCR扩增, 分析基因在接种赤条病菌24 h、48 h、72 h (处理组)及以接种无菌水0 h (对照组)的相对表达量。RT-qPCR反应体系包含10 μL TB Green Premix ExII、2 μL模板(5× cDNA稀释液)、0.4 µL上/下游引物(10 μmol μL–1)、0.4 μL ROX Reference Dye II和6.8 μL无菌水。反应扩增条件为95℃ 30 s; 95℃ 5 s; 60℃ 34 s, 共40个循环。每个样品设3次生物学重复和3次技术重复。RT-qPCR数据处理根据2–∆∆Ct法计算基因相对表达量。

1.6 转录组和蛋白质组数据分析

以新台糖22号和闽糖11-610为供试品种, 处理组用针刺法接种赤条病菌, 对照组用无菌水模拟接菌, 接种0、24、48、72 h采集叶片样品。叶片总RNA委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行cDNA文库构建和Illumina HiSeq平台测序, 获得高质量的转录组数据库(PRJNA579959)[24]。另外, 提取接种0 h 和24 h 后的甘蔗叶片的总蛋白, 将蛋白质样品委托北京诺禾致源科技股份有限公司, 采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术开展蛋白质组试验, 获得高质量的差异表达蛋白质谱(PXD021430)[23]。差异表达基因和蛋白用log2FC表示, 即2组实验处理间表达量的比值, 然后对其取以2为底的对数值。

1.7 数据统计分析

甘蔗应答胁迫的不同处理时间采用单因素方差分析, 组间平均值多重比较采用检验法。以上数据统计分析采用SPSS 19.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 ScPR10基因的克隆与理化性质分析

以新台糖22号、闽糖11-610接种后的甘蔗叶片总RNA为模板, 利用RT-PCR技术扩增出2条长度约700 bp的条带, 测序结果表明为基因。从新台糖22号品种克隆获得的基因(NCBI数据库登录号OK290572)全长为697 bp, 包含1个564 bp的完整开放阅读框ORF和1个133 bp的3¢端非编码区序列(3¢UTR); 从闽糖11-610品种克隆获得的基因(NCBI数据库登录号OK290571)全长为695 bp, 包含1个564 bp的完整ORF和1个131 bp的3¢UTR (表1)。蛋白一级结构预测分析表明, 2个基因序列编码187个氨基酸, 存在5个氨基酸差异; 理论分子量、等电点和不稳定系数数值很接近或相同; 疏水性的平均值也很相近, 说明这2个ScPR10蛋白为疏水性蛋白。

2.2 ScPR10蛋白的高级结构分析

ScPR10蛋白的二级结构和三级结构预测结果表明, 这2个ScPR10蛋白的二级结构相似, 主要由α-螺旋(alpha helix)、无规则卷曲(random coil)、延伸链(extended strand)和β-折叠(beta sheet) 4种构象组成。其中α-螺旋所占比例最多, 为41.7%～44.9%; 其次是无规则卷曲, 占30.5%～33.2%; 延伸链占16.6%～17.1%; β-折叠所占比例最小, 为8.02% (图1-A, B); 三级结构由反向平行的7股β-折叠和3个α-螺旋, 以及连接这些结构的9个短环loop组成(图1-C)。

表1 甘蔗ScPR10蛋白的理化性质

图1 甘蔗ScPR10蛋白结构分析

A和B分别是来自新台糖22号和闽糖11-610的ScPR10蛋白二级结构; C为甘蔗ScPR10蛋白三级结构; 蓝色、粉红色、红色和绿色分别表示α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-折叠; α (1～3)、β (1～7)和L (1～9)分别表示α-螺旋、β-折叠和环肽链。

A and B present the secondary structures of ScPR10 proteins from ROC22 and MT11-610 varieties, respectively, and C shows the tertiary structures of ScPR10 proteins.-helix, irregular curl, extended chain, and β-sheet are shown in blue, pink, red, and green colors, respectively. α (1–3): alpha-helix; β (1–7): beta-sheet; L (1–9): loop.

2.3 ScPR10蛋白的序列比对和发育进化分析

从NCBI数据库下载不同物种PR10蛋白同源序列, 包括甘蔗spp.hybrid (AMQ67074.1)、高粱(AAW83207.1)、斑茅(AJI77535.1)、黍子(RLN41266.1)、玉米(ADA68331.1)、小麦(ACG68733.1)和水稻(AF395880.1), 连同本研究克隆获得的2个甘蔗品种ScPR10蛋白进行序列比对分析。由图2可知, 不同物种的PR10蛋白含有相同的保守结构域P-loop (GXGGXG)和Bet v 1; 与其他物种和1条已报道的来自甘蔗栽培种的ScPR10序列(AMQ67074.1)相比, 来自甘蔗栽培品种闽糖11-610和新台糖22号的ScPR10蛋白的氨基酸数目多了27个氨基酸。

系统进化树分析结果显示, 本研究获得的2条ScPR10蛋白序列与已报道的甘蔗品种ScPR10 (AMQ67074.1)亲缘关系最近, 其次是高粱和甘蔗近缘属斑茅的PR10蛋白(图3-A)。本研究获得的这2条甘蔗ScPR10蛋白序列一致性达96.8%, 与已报道的甘蔗栽培种和斑茅PR10序列一致性分别为93.7%～ 95.6%和90%～91.8%, 与高粱和黍子PR10序列一致性分别为83.8%～85.6%和84.4%～86.2% (图3-B)。

图2 几种禾本科植物PR10蛋白序列多重比对

P-loop保守结构域用红色方框表示, Bet v 1用下画线标注, 疏水性蛋白结合位点用黄色三角符号表示。

The conserved domains of P-loop and Bet v 1 are indicated by a red box and underline, respectively. The hydrophobic ligand binding site is marked with yellow triangles.

图3 几种禾本科植物PR10蛋白的系统进化树分析(A)和一致性热图(B)

2.4 ScPR10基因响应Aaa胁迫的转录表达分析

以新台糖22号和闽糖11-610植株幼苗接种病菌0、24、48、72 h时的甘蔗叶片总RNA为模板, RT-qPCR定量分析表明, 甘蔗受侵染后, 在抗病品种新台糖22号和感病品种闽糖11-610中, 2个基因的表达模式基本一致, 在接种后24 h达到峰值, 随后表达量逐渐下降; 在接种24 h时, 这2个基因在抗、感品种上分别比接种0 h对照组提高了27.2倍和39.7倍(图4-A)。根据本课题组前期获得的甘蔗响应胁迫的转录组数据发现, 新台糖22号的基因受诱导显著上调表达, 在接种后48 h表达量略有回落, 在接种后72 h表达量最高, 为对照组的5.3倍; 闽糖11-610的基因持续上调高表达水平, 在接种后72 h表达量达最大值, 是对照组的5.4倍(图4-B)。

2.5 ScPR10互作蛋白预测及转录后表达分析

利用StringDB蛋白质互作数据库预测ScPR10的互作蛋白及互作网络发现, ScPR10与属于ABC转运蛋白家族中的植物多向耐药性PDR (pleiotropic drug resistance) 蛋白亚家族成员(基因编号Cluster- 13677.282407)和蛋白激酶成员(基因编号Cluster- 13677.166559)存在互作关系(图5)。基于本课题组前期获得的甘蔗应答胁迫的蛋白组数据, 在抗病品种新台糖22号和感病品种闽糖11-610中, 这2个ScPR10蛋白在胁迫24 h时均为上调表达, 与接种0 h对照组相比, 其log2(FC)值为1.65～1.69。与ScPR10互作的PDR蛋白亚家族成员在抗、感品种略有上调表达, 与接种0 h对照组相比, 其log2FC值分别为1.00和0.92; 与ScPR10互作的蛋白激酶成员在新台糖22号品种上表达量没有变化, 但是在闽糖11-610品种上的表达里略有提高, log2FC值为1.13。

图4 甘蔗ScPR10基因应答Aaa胁迫的转录表达模式

A: RT-qPCR验证; B: 转录组数据(log2FC)。新台糖22号(ROC22)为抗病品种, 闽糖11-610 (MT11-610)为感病品种。柱上不同小写字母表示显著差异(< 0.05)。

A: qRT-PCR assay; B: the transcriptome data (log2FC). ROC22 and MT11-610 are resistant and susceptible to red stripe disease, respectively. Different lowercase letters above the bars indicate significant differences at< 0.05.

图5 ScPR10及其互作蛋白的转录后表达水平

蓝色、红色方框数值表示抗、感病品种在胁迫24 h (R24或S24)与对照组处理0 h (CK0)的蛋白表达量的比值, 用log2FC值表示。

The values of log2FC in blue and red boxes are the ratios of protein expression level of resistant (R24) or susceptible (S24) variety at 24 hours post inoculation (hpi) versus at 0 hpi (CK0), respectively.

3 讨论

PR10蛋白是一种结构保守且发挥多种功能的病程相关蛋白质, 在植物生长发育阶段和应激外界刺激时发挥重要作用[17]。PR10蛋白含有“P-loop”保守结构域与核酸酶活性密切, 被认为与抗微生物活性有关[25]; 另一个保守功能域Bet v 1除了与核酸酶活性有关, 还与具有与配体结合位点[17]。本文克隆获得的ScPR10蛋白同样含有P-loop和Bet v 1保守功能域, 但是与其他物种和已发表的甘蔗栽培种新台糖22号的PR10相比, N端多了27个氨基酸, 这可能是由于基因表达时可变剪切(Alternative splicing)引起, 因为本文报道的这2个基因是基于甘蔗应答侵染的转录组unigene序列设计扩增引物, 并采用RT-PCR方法克隆获得。越来越多的研究表明可变剪切对植物蛋白质多样性和/或提高应对外界环境胁迫的调节能力是至关重要[26-27]。

Peng等[21]从甘蔗品种新台糖22号克隆获得了ScPR10蛋白, 研究表明该蛋白在新台糖22号受到黑穗病菌和高粱花叶病毒侵染后明显高表达。张玉等[28]研究发现, 烟草基因无论在烟草抗病或感病品种上, 受到赤星病菌侵染后均显著上调表达, 但是在抗病品种的响应速度和表达量显著高于感病品种。本研究发现,基因在甘蔗赤条病抗、感品种中都是显著上调表达, 但是上调水平基本一致, 这一研究结果与张玉等研究结果[28]有所差异, 可能是由于甘蔗基因在抗、感品种上具有相同的防御功能, 是甘蔗应对环境逆境胁迫的一种普遍存在的防御蛋白。总之, 植物PR10在响应病原微生物胁迫的防御反应中起到重要作用, 这研究结果为甘蔗的抗病机制研究提供一个很好的切入点, 也为进一步解析该基因在甘蔗转基因抗病分子育种上的应用奠定基础。

通过蛋白互作软件在线预测到ScPR10蛋白可能与植物多向耐药性PDR蛋白(Cluster-13677.282407)互作, 它属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCG亚家族成员, 这个蛋白在甘蔗抗、感赤条病品种上均表现为上调表达模式, 我们推测该蛋白正向协同参与甘蔗应答侵染的防御通路上。有研究表明植物PDR型ABCG转运蛋白通过细胞膜运输各种各样的分子的形式, 在植物应对各种生物和非生物胁迫中起到很重要的作用[29-30]。虽然它们的详细转运机制尚不清楚, 但它们在解毒过程、防止脱水、植物激素转运和次生代谢产物中发挥着重要作用[29-31]。比如, Shibata等[32]利用病毒诱导的基因沉默技术鉴定了烟草PDR型ABCG转运蛋白和基因对马铃薯晚疫病菌的抗性至关重要。PR10蛋白与核酸酶活性密切, 可以通过从被感染的宿主细胞释放PR10并直接作用于病原体, 进而降解其核酸, 或者在植物感染组织部位及其周围的细胞程序性死亡过程中发挥作用[25]。PR10与PDR型ABCG转运蛋白如何协同调控植物抗病性的机制尚未清楚, 值得下一步探究。

4 结论

本研究从抗赤条病品种新台糖22号和感赤条病品种闽糖11-610中克隆获得2个基因, 从转录和蛋白表达水平解析甘蔗植株接种病菌之后的基因表达特性, 发现来自甘蔗抗病和感病品种的基因在防御病菌的胁迫中起到正向调控作用; 另外, 蛋白互作预测发现ScPR10可能与PDR型 ABCG转运蛋白互作, 正向协同调控甘蔗应答Aaa病菌侵染。

[1] Aono A H, Pimenta R J G, Garcia A L B, Correr F H, Hosaka G K, Carrasco M M, Cardoso-Silva C B, Mancini M C, Sforça D A, Dos Santos L B, Nagai J S, Pinto L R, Landell M G A, Carneiro M S, Balsalobre T W, Quiles M G, Pereira W A, Margarido G R A, de Souza A P. The wild sugarcane and sorghum kinomes: Insights into expansion, diversification, and expression patterns., 2021, 12: 668623.

[2] 刘晓雪, 邬志军. 2020/2021榨季国内外食糖市场回顾与2021/2022榨季展望. 中国糖料, 2021, 43(4): 81–88.

Liu X X, Wu Z J. Domestic and foreign sugar markets in 2020/2021 crushing season and their prospect for 2021/2022 crushing season., 2021, 43(4): 81–88 (in Chinese with English abstract).

[3] Fontana P D, Fontana C A, Bassi D, Puglisi E, Salazar S M, Vignolo G M, Coccocelli P S. Genome sequence ofstrain T10_61 associated with sugarcane red stripe in Argentina., 2016, 4: e01669.

[4] Li X Y, Sun H D, Rott P C, Wang J D, Huang M T, Zhang Q Q, Gao S J. Molecular identification and prevalence ofsubsp.causing red stripe of sugarcane in China., 2018, 67: 929–937.

[5] Rott P C, Davis M J. Red stripe (top rot). In: Rott P C, Bailey R A, Comstock J C, Croft B J, Saumtally A S, eds. A Guide to Sugarcane Diseases. Montpellier, France: CIRAD/ISSCT, 2000. pp 58–62.

[6] 储娜, 孙会东, 周敬如, 傅华英, 李晓燕, 高三基. 甘蔗赤条病及其病原生物学研究进展. 中国糖料, 2020, 42(1): 5.

Chu N, Sun H D, Zhou J R, Fu H Y, Li X Y, Gao S J. Research advances of sugarcane red stripe disease and its pathogeny bio­logy., 2020, 42(1): 5 (in Chinese with English abstract).

[7] Fontana P D, Rago A M, Fontana C A, Vignolo G M, Cocconcelli P S, Mariotti J A. Isolation and genetic characterization offrom red stripe infected sugarcane in northwestern Argentina., 2013, 137: 525–534.

[8] Shan H, Li W, Huang Y, Wang X, Zhang R, Luo Z, Yin J. First detection of sugarcane red stripe caused bysubsp.in Yuanjiang, Yunnan, China., 2017, 42: 137–141.

[9] Loon L, Strien E. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins., 1999, 55(2): 85–97.

[10] Joshi V, Joshi N, Vyas A, Jadhav S K. Biocontrol agents second metabolites. Cambridge: Woodhead Publishing, 2021. pp 573–590.

[11] Zribi I, Ghorbel M, Brini F. Pathogenesis related proteins (PRs): from cellular mechanisms to plant defense., 2021, 22: 1–17.

[12] Loon L V, Rep M, Pieterse C. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants., 2006, 44: 135–162.

[13] Somssich I E, Schmelzer E, Kawalleck P, Hahlbrock K. Gene structure and in situ transcript localization of pathogenesis-related protein 1 in parsley., 1988, 213: 93–98.

[14] Liu J J, Ekramoddoullah A. The family 10 of plant pathogenesis-related proteins: their structure, regulation, and function in response to biotic and abiotic stresses., 2006, 68: 3–13.

[15] Bantignies B, Séguin J, Muzac I, Dédaldéchamp F, Gulick F, Ibrahim R. Direct evidence for ribonucleolytic activity of a PR-10-like protein from white lupin roots., 2000, 42: 871–881.

[16] Souza T P, Dias R O, Silvafilho M C. Defense-related proteins involved in sugarcane responses to biotic stress., 2017, 40: 360–372.

[17] 杨涛, 王艳. 植物病程相关蛋白PR-10的研究进展.植物生理学报, 2017, 53: 2057–2068.

Yang T, Wang Y. Research progress of plant pathogenesis related protein PR-10., 2017, 53: 2057–2068 (in Chinese with English abstract).

[18] Xie Y R, Chen Z Y, Brown R L, Bhatnagar D. Expression and functional characterization of two pathogenesis-related protein 10 genes from., 2010, 167: 121–130.

[19] He M Y, Xu Y, Cao J L, Zhu Z G, Jiao Y T, Wang Y J, Guan X, Yang Y Z, Xu W R, Fu Z F. Subcellular localization and functional analyses of a PR10 protein gene fromin response toinfection., 2013, 250: 129–140.

[20] Oloriz M I, Gil V, Rojas L, Portal O, Izquierdo Y, Jiménez E, Höfte M. Sugarcane genes differentially expressed in response toinfection: identification and transcript profiling., 2012; 31: 955–969.

[21] Peng Q, Su Y C, Ling H, Ahmad W, Gao S W, Guo J L, Que Y X, Xu L P. A sugarcane pathogenesis-related protein, ScPR10, plays a positive role in defense responses under, SrMV, SA, and MeJA stresses., 2017,36: 1427–1440.

[22] Que Y X, Su Y C, Guo J L, Wu Q B, Xu L P. A global view of transcriptome dynamics duringchallenge in sugarcane by RNA-seq., 2014, 9: e106476.

[23] Zhou J R, Sun H D, Ali A, Rott P C, Gao S J. Quantitative proteomic analysis of the sugarcane defense responses incited bysubsp.causing red stripe., 2021, 162: 113275.

[24] Chu N, Zhou J R, Fu H Y, Huang M T, Zhang H L, Gao S J. Global gene responses of resistant and susceptible sugarcane cultivars tosubsp.identified using comparative transcriptome analysis., 2020, 8: 10.

[25] Agarwal P, Agarwal P K. Pathogenesis related-10 proteins are small, structurally similar but with diverse role in stress signaling., 2014, 41: 599–611.

[26] Chaudhary S, Jabre I, Reddy A S N, Staiger D, Syed N H. Perspective on alternative splicing and proteome complexity in plants., 2019, 24: 496–506.

[27] Martín G, Márquez Y, Mantica F, Duque P, Irimia M. Alternative splicing landscapes inacross tissues and stress conditions highlight major functional differences with animals., 2021, 22: 1–26.

[28] 张玉, 王杰, 周世奇, 郑甜甜, 罗成刚, 王元英. 烟草PR10蛋白生物活性及赤星病菌诱导下的表达分析.植物保护学报, 2018, 45: 455–462.

Zhang Y, Wang J, Zhou S Q, Zheng T T, Luo C G, Wang Y Y. Biological activity of tobacco PR10 protein and expression analysis induced by., 2018, 45: 455–462 (in Chinese with English abstract)

[29] Nuruzzaman M, Zhang R, Cao H Z, Luo Z Y. Plant pleiotropic drug resistance transporters: Transport mechanism, gene expression, and function., 2014, 56: 729–740.

[30] Dahuja A, Kumar R R, Sakhare A, Watts A, Singh B, Goswami S, Sachdev A, Praveen S. Role of ATP-binding cassette transporters in maintaining plant homeostasis under abiotic and biotic stresses., 2021, 171: 785–801.

[31] 贺祯媚, 李东明, 齐艳华. 植物ABCB亚家族生物学功能研究进展. 植物学报, 2019, 54: 688–698.

He Z M, Li D M, Qi Y H. Advances in Biofunctions of the ABCB Subfamily in Plants., 2019, 54: 688–698 (in Chinese with English abstract).

[32] Shibata Y, Ojika M, Sugiyama A, Yazaki K, Jones D A, Kawakita K, Takemoto D. The full-size ABCG transporters Nb-ABCG1 and Nb-ABCG2 function in pre- and postinvasion defense againstin., 2016, 28: 1163–1181.

Gene cloning and expression analysis ofin sugarcane undersubsp.infection

LI Juan, ZHOU Jing-Ru, CHU Na, SUN Hui-Dong, HUANG Mei-Ting, FU Hua-Ying, and GAO San-Ji*

National Engineering Research Center for Sugarcane, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

PR10 is a pathogenesis-related protein (PR), which plays critical roles in the growth and development and various environmental stress responses in plants. This study demonstrated that twogenes were cloned from the leaf samples of ROC22 (resistant to red stripe) and Mintang 11-610 (susceptible to red stripe) by RT-PCR, and then RT-qPCR, transcriptome, and proteomics assays were carried out to explore the expression patterns of two genes in varieties ROC22 and Mintang 11-610 post inoculation with red stripe pathogensubsp.(). Sequence analysis showed that the twogenes encoding 187 amino acids had more 27 amino acids than PR10 proteins from other plants, which contained the conserved domains P-loop and Bet v 1. ScPR10 obtained in this study shared high homology with these published PR10 proteins encoded byspp.,, and. The RT-qPCR analysis showed that the relative expression levels ofgenes were significantly increased by 27.2 times and 39.7 times in the resistant and susceptible varieties underinfection, especially at 24 hours post inoculation (24 hpi), compared with the controls (0 hpi), respectively. Meanwhile, the transcriptome data revealed that the relative expression levels ofgenes were significantly increased by 5.3–5.4 folds [log2(Fold Change)] in the two varieties underinfection, particular at 72 hours post inoculation (72 hpi). Prediction of protein interaction revealed that ScPR10 would interact with the pleiotropic drug resistance (PDR) protein of ABCG transporter subfamily (Cluster-13677.282407) and protein kinase (Cluster-13677.166559). Proteomics analysis referred that the relative expression of ScPR10 proteins were increased by 1.65–1.69 folds (log2FC) evaluated by 24 hpi versus 0 hpi in resistant and susceptible varieties. Similarly, the relative expression levels of the ABC transporter (Cluster-13677.282407) were upregulated to a certain extent in two varieties, but the relative expression levels of protein kinase (Cluster-13677.166559) were only enhanced in Mintang 11-610, not in ROC22. In conclusion, the ScPR10 may synergize with the ABC transporter (Cluster-13677.282407) involving in the defense response in sugarcane in response toinfection.

PR10 protein;subsp.; biotic stress; gene expression;spp.

10.3724/SP.J.1006.2023.14239

本研究由财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设专项(糖料, CARS-170302)和国家甘蔗工程技术研究中心主任基金项目(KJG16005M)资助。

This study was supported by the Earmarked Fund of the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-170302) and the Director’s Innovation Fund in National Engineering Research Center for Sugarcane, FAFU, China (KJG16005M).

通信作者(Corresponding author):高三基, E-mail: gaosanji@fafu.edu.cn

E-mail: lj09172023@163.com

2021-12-17;

2022-03-25;

2022-04-20.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220418.1729.038.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).