miR-499基因家族进化分析及其对鸡骨骼肌肌纤维类型调控的研究

2023-01-11石诗影巨晓军屠云洁单艳菊姬改革刘一帆束婧婷

家畜生态学报 2022年12期

石诗影，巨晓军，屠云洁，单艳菊，姬改革，刘一帆,2，章明，束婧婷*

(1. 江苏省家禽科学研究所/江苏省家禽遗传育种重点实验室，江苏扬州 225125；2. 江苏省家禽科学研究所科技创新有限公司，江苏扬州 211412)

肌肉中的氧化型肌纤维(慢肌)含量越高、酵解型肌纤维(快肌)含量越低时，肌肉的主要品质指标趋好，如pH、肉色、系水力、肌内脂肪和风味物质含量等[1-3]。而肌纤维的类型在动物生长过程中并不是固定的，不同类型肌纤维之间的转化十分常见。因此，骨骼肌肌纤维类型转化规律是肉质研究的关键切入点。解析骨骼肌肌纤维类型转化机理并应用于育种生产，对于加速优质肉鸡品种培育、加快优质肉鸡行业产业化发展有着重要的理论和实践意义。

microRNA(miRNA)是一类内源性的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们能够在动植物中广泛参与基因表达调控，从而参与机体的细胞增殖、分化、凋亡、能量代谢和信号转导等过程[4]。已经证实许多miRNA在肌肉功能的调控中发挥关键作用，其中大部分miRNA在各个组织中广泛表达，少部分在肌肉中特异性表达，即myomiRs(muscle-specific miRNAs)[5]。miR-499是最新报道的myomiRs成员，在骨骼肌和心肌中特异性表达[6]。越来越多的研究表明，miR-499在骨骼肌肌纤维类型转化过程发挥着重要的调控作用。Van Rooij等[7]报道miR-499-5p敲除后小鼠比目鱼肌的I型肌纤维数目明显减少。Nachtigall等[8]在罗非鱼的研究发现miR-499在骨骼肌慢肌纤维中的表达量远高于快肌。SOX6已经被证实是miR-499的关键靶基因。在心肌中，miR-499能通过抑制SOX6的表达促进心肌细胞的分化[9]。

在前期的高通量测序表明，miR-499在鸡快肌和慢肌组织中差异表达显著，推测miR-499在鸡骨骼肌肌纤维类型转化也具有重要的作用[10]。为了进一步研究miR-499在鸡骨骼肌肌纤维类型调控的功能，本研究通过对miR-499进行序列进化分析、靶基因预测、鉴定和表达量分析，旨在为进一步揭示miR-499在骨骼肌肌纤维类型转化的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物试验采用的清远麻鸡来自广东天农食品集团股份有限公司。种蛋孵化后，在同样的环境和饲养条件下进行饲养，全程自由采食和饮水。

1.1.2 主要试剂和仪器 TRNzol总RNA提取试剂(DP405)、荧光定量预混试剂 (SYBR Green) (FP215)，FastKing cDNA第一链合成试剂盒( KR116)购自TIANGEN公司；DNA Marker DL2000为TaKaRa公司产品。9700PCR仪和Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)；凝胶成像系统(Tanon 2500)；紫外分光光度计(Nano Drop One，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 获取miR-499序列和基因组位置信息从miRBase数据库22.1(http://www.mirbase.org/)中下载所有脊椎动物的miR-499前体序列和成熟序列。利用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，以10种典型脊椎动物的miRNA-499基因家族前体序列作为查询序列(Query sequence)，在基因组中进行比对，以确定miR-499的基因组位置以及来源基因。

1.2.2 多序列比对和系统发育树构建利用ClustalX 1.83软件对所有的miR-499成熟序列进行多序列比对(Multiple sequences alignment)。以前体序列为输入序列，通过MEGA7.0软件构建系统进化树，选择基于距离参数的邻接法(Neighbor-joining，NJ)，并自举检验1000次。

1.2.3 靶基因预测选择在线软件targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)分别预测鸡miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因，取两种工具输出结果的交集作为候选靶基因。

1.2.4 靶基因功能分析利用DAVID在线工具(https://david.ncifcrf.gov/)对预测到的靶基因进行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，采用超几何分布检验方法计算各个条目或通路中差异基因富集的显著性。

1.2.5 miR-499-5p和SOX6在鸡骨骼肌中的表达检测选择体重接近的20周龄清远麻鸡母鸡6只，放血屠宰后采集胸大肌(pectoralis major)和腿缝匠肌(sartorius)组织。肌肉总RNA提取用Trizol法，RNA样品检测合格后，取2 μg总RNA进行反转录合成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR),使用的引物见表1。反应体系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL( 10 μmol/L)， cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加dd H2O补足20 μL。反应条件为： 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 20 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 60 s，共 40 个循环。每次反应均设空白样品为阴性对照，每个样品设置3个平行。

表1 试验使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.6 miR-499-5p和SOX6靶向调控关系验证通过PCR扩增获得具有miR-499-5p结合位点的SOX6 3'UTR序列，并通过重叠PCR获得结合位点突变后的3'UTR序列。经测序验证后将两段序列分别克隆至pMIR-RB-ReporterTM双荧光素酶报告载体。将野生型和突变型载体分别与miR-499-5p mimic或mimic NC共转染DF-1细胞。转染24 h后，参照Dual Luciferase Reporter Assay System试剂盒的说明书步骤进行操作，并使用酶标仪进行荧光素酶活性的测定。

1.2.7 统计分析表达量结果采用2-△△Ct法进行处理。采用 SPSS 20.0软件进行分析，组间差异显著性用独立样本t检验(Independent-samplesttest)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 miR-499基因家族及其在基因组中的定位

在miRBase22.1数据库中共查询到43种脊椎动物的49条miRNA-499基因家族前体序列，其中大部分脊椎动物例如小鼠、山羊、鸡等具有miR-499基因家族的1个成员；棉耳狨猴、人、斑点叉尾鮰具有miR-499基因家族的 2 个成员(miR-499a、miR-499b)；大西洋鲑具有miR-499基因家族的 4 个成员(miR-499a、miR-499b-1、miR-499b-2、miR-499b-3)。

在数据库中共查询到43种脊椎动物75条miRNA-499基因家族成熟序列，其中大部分脊椎动物例如小鼠、山羊、鸡等具有miR-499基因家族的两个成熟序列(miR-499-5p，miR-499-3p)；慈綢鱼、牛、鲤鱼、犬、大猩猩、斑点叉尾鮰、大斑马、鯛魚、青鳉、尼罗罗非鱼、奈里朴丽鱼、黑猩猩、树鼩、热带爪蟾、大棕蝠只有miR-499基因家族的一个成熟序列；人、大西洋鲑具有miR-499基因家族的4个成熟序列。

10种典型脊椎动物的miRNA-499在基因组的位置见表2。miR-499均定位在内含子区域，关联基因为MYH7B。

表2 miR-499基因家族成员在基因组的分布特征Table 2 Genomic location of miR-499 gene family

2.2 miR-499基因家族序列同源性分析

利用ClustalX软件对miR-499基因家族43种物种的成熟序列进行多序列比对分析(图1) ,结果显示，miR-499基因成熟序列具有较高的同源性。miR-499-5p保守碱基数为19个，miR-499-3p保守碱基数为14个，说明保守性较高。miRNA的seed序列(5'端第 2-8 个核苷酸)负责在与基因3'UTR特异性结合，对于miRNA功能的行使十分重要，因此这段序列通常十分保守，本研究亦证实了这一点。miR-499的部分位点在不同物种发生了核苷酸突变和缺失，导致miR-499基因家族成员间的成熟序列长度产生变化。

图1 miR-499基因家族的成熟序列多重比对Fig. 1 Multiple sequences alignment of mature sequence among the miR-499 family

目前，部分miR-499成熟序列并未区分其来源于前体序列的5p或3p端。经过序列比对，其中大棕蝠、斑点叉尾鮰、犬、牛、鯛魚、奈里朴丽鱼、大斑马、慈綢鱼、尼罗罗非鱼、鲤鱼、热带爪蟾的miR-499成熟序列与miR-499-5p同源性较高，提示其来源于成熟序列的5p端；黑猩猩、青鳉的miR-499的成熟序列来源于3p端。

2.3 miR-499基因家族成员系统进化分析

利用MEGA7.0软件对43种脊椎动物的49条miRNA-499基因家族前体序列构建NJ系统发育进化树。由图2可知，进化树首先被分割为2大支：第1大支是人和普通狨miR-499b，其余前体序列为第2支；第2大支又继续分为3支：第1分支主要聚集的是哺乳类动物；第2分支主要聚集的是鱼类；第3分支主要是爬行类动物和鸟类，爬行类聚集在一起，鸟类聚集在一起。进化树分支划分符合物种分类规律，由此可以猜测，各物种的miRNA-499基因家族在进化过程中符合物种进化演变的规律。

图2 利用NJ法构建脊椎动物miR-499前体序列系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of the miR-499 family constructed based on Neighbor-joining method

2.4 鸡miR-499靶基因预测及功能分析

利用targetscan和miRDB在线工具对鸡miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因进行预测，取两者预测结果的交集，分别获得78个和245个靶基因。利用DAVID在线工具对靶基因进行GO和KEGG富集分析(表3&表4)。结果发现，miR-499-5p的靶基因显著富集于细胞应对转化生长因子刺激，丝氨酸/苏氨酸激酶活性调控，转录因子活性和细胞内吞信号通路等(P<0.05)。miR-499-3p的靶基因显著富集于组织发育，cAMP信号，ARF蛋白信号转导，MAPK信号，泛素介导的蛋白水解作用和细胞内吞信号通路等(P<0.05)。

表3 鸡miR-499-5p靶基因显著富集的GO条目和信号通路Table 3 GO and pathway enrichment of target genes for chicken miR-499-5p

表4 鸡miR-499-3p靶基因显著富集的GO条目和信号通路Table 4 GO and pathway enrichment of target genes for chicken miR-499-3p

2.5 miR-499和SOX6表达分析

为验证鸡miR-499-5p与预测靶基因SOX6的表达关系，本研究选择快肌为主的胸大肌和慢肌为主的腿缝匠肌，检测了miR-499-5p和SOX6在两种肌肉中的表达水平。结果发现，miR-499-5p的表达量在缝匠肌中极显著高于胸大肌(P<0.01)，SOX6在缝匠肌中表达水平极显著低于胸大肌(P<0.01)，且两者的表达呈强的负相关(r=-0.92)。

图3 不同鸡骨骼肌组织中miR-499-5p和SOX6的表达量**表示差异极显著(P<0.01)。下图同Fig.3 miR-499-5p and SOX6 expression level from different skeletal muscle tissues** shows highly significant difference (P<0.01). The same below

2.6 miR-499和SOX6靶向结合关系分析

为进一步鉴定miR-499的靶基因，将SOX6野生型、突变型3'UTR与miR-499-5p mimic和mimic NC共转染后，检测双荧光素酶活性。如图4所示，当共转染野生型SOX6时，与mimic NC组相比，miR-499-5p mimic组荧光素酶活性受到极显著抑制(P<0.01)；而共转染突变型SOX6时，mimic NC组和miR-499-5p mimic组差异不显著(P>0.05)。结果表明，SOX6是miR-499-5p的靶基因。

图4 双荧光素酶活性检测结果Fig.4 Dual luciferase activity detection

3 讨论

miRNA作为调控基因表达的重要内源性非编码小分子RNA，几乎参与调节所有的生物学过程，包括细胞生长和分化、肌肉发育和脂肪代谢等。miRNA主要通过与靶基因mRNA 3'UTR不完全互补配对，在转录后水平抑制靶基因的作用。早期报道的一些miRNA基因家族，如miR-23[11]、miR-223[12]，在物种间具有高度的保守性，与非保守的miRNA相比具有更为明确的生物学功能，因此更值得进行深入研究。

miR-499属于肌肉特异性表达miRNA，在小鼠等物种研究中表明其在肌肉发育和分化中发挥着广泛的功能，但在鸡上缺少相关研究。本研究发现miR-499广泛存在于大多数脊椎动物之中，且在各个物种中序列高度保守。这种保守性尤其是种子区的保守性，预示其在不同物种间将具有类似的功能，这为借鉴相关研究理解鸡miR-499的生物学功能提供了便利。目前发现人miR-499由肌球蛋白重链7B(MYH7B)的内含子编码，主要在心肌和骨骼肌组织表达，并且与MYH7B基因呈现协同表达的趋势[6]。本研究也发现在10种脊椎动物中miR-499均由MYH7B内含子编码。同时，进化树结果显示miR-499序列进化特征符合物种进化演变规律，提示miR-499在生物迁移和进化过程中具有重要作用。

靶基因预测是探索miRNA功能的有效手段。本研究通过对鸡miR-499的两种成熟体进行靶基因预测，并进行GO和KEGG分析。结果显示miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因显著富集于肌纤维类型相关的GO条目和信号通路，包括丝氨酸/苏氨酸激酶活性调控[13]、cAMP信号[14]和MAPK通路[15]。Van Rooij等[7]报道敲除miR-499-5p后，小鼠肌纤维出现明显的慢肌向快肌的转变。李志雄等[16]报道了在肉鸡腓肠肌注射miR-499-5p后，肌肉差异基因主要参与丝氨酸/苏氨酸激酶活性调控和MAPK通路。本研究的表达试验发现，miR-499在慢肌中的表达量显著高于快肌。综合以上结果，推测miR-499可能促进鸡骨骼肌慢肌纤维的形成，抑制快肌纤维的形成。

SOX6是miR-499最重要的靶基因之一。在心肌中，miR-499能够靶向SOX6抑制其表达，从而参与细胞损伤修复和凋亡调节[17-18]。骨骼肌方面，研究人员已经在猪和斑马鱼上证实了miR-499能够通过调控SOX6表达，进而参与调控肌纤维类型的转化[8,19]。张梓豪等[20]通过表达试验初步证实了SOX6基因具有促进鸡骨骼肌快肌纤维形成的作用。本研究发现miR-499-5p和SOX6在鸡肌肉组织中呈现相反的表达模式。进一步通过双荧光素酶试验验证了miR-499-5p和SOX6的靶向关系，提示SOX6在鸡上也能够被miR-499抑制。