与哺乳动物配子发生相关的ncRNA研究进展

陈薪全，甘麦邻，沈林園，赵 叶，陈 蕾，张顺华，牛丽莉，朱 砺

(四川农业大学 动物科技学院，四川 成都 611 30)

哺乳动物的配子包括精子和卵子，两者结合形成受精卵，而受精卵是个体发育的起点。原始生殖细胞是精子和卵子的前体细胞，其起源于原始外胚层，经有丝分裂后数量增加，并聚集于中胚层和内胚层附近，随后迁移到生殖嵴，周围的体细胞微环境使其分化为精原细胞或卵原细胞，再经减数分裂产生精细胞或卵细胞。精细胞和卵细胞进一步成熟成为精子和卵子，成熟的精子获能后在输卵管壶腹部与卵子结合，完成受精过程，形成受精卵，再进一步发育形成早期胚胎，并最终形成个体。

配子发生是一个复杂的生物学过程，受到许多因素的调控，对这些调控作用的研究有利于我们增强对配子发生过程的理解。ncRNA是一类不直接发挥作用，但可以通过转录水平、转录后水平和表观遗传水平发挥作用的RNA分子，是当前生物领域研究的热点之一。本文归纳了ncRNA在配子发生过程中的相关研究，对ncRNA在配子发生、早期胚胎发育和不孕不育症中的调控作用进行了总结，以期为进一步阐明ncRNA在配子发生和早期胚胎发育过程中的调控机制，并为不孕不育症的诊断和治疗提供参考。

1 ncRNA的调控机制

人类基因组研究发现约2%的核酸序列用于编码蛋白质，其余的核酸序列属于ncRNA，这些ncRNA曾被认为是“基因组噪声”，不具有生物学功能，随着研究的深入，ncRNA的生物学功能被人类逐一揭示。ncRNA是一类没有蛋白编码能力的RNA分子，在许多生命活动中起重要作用，如调控细胞增殖、分化等过程。近年来，随着对ncRNA研究的不断深入，ncRNA在动物体内的功能调控机制逐渐被揭示，ncRNA的发现及其调控功能的阐明对现代生命科学具有重要意义。目前研究较多的ncRNA包含长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、microRNA(miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)，不同的ncRNA的特征、调控机制各有不同(表1)。

表1 5个ncRNA的功能调控机制Table 1 The functional regulation mechanism of 5 ncRNAs

2 与精子发生相关的ncRNA

哺乳动物的精子发生位于睾丸曲细精管中，曲细精管中的精子并不具备受精能力，精子还要在附睾内进一步达到功能成熟，并在雌性生殖道内获能才具有使卵子受精的能力。精子发生是一个连续且复杂的细胞增殖、分化过程，该过程受到一系列精确的调控。近年来，研究者们利用测序分析技术挖掘出许多参与精子发生过程的ncRNA(表2)。

表2 ncRNA调控精子发生Table 2 ncRNA regulates spermatogenesis

2.1 参与精子发生过程的lncRNA

研究表明，在哺乳动物雄性生殖细胞中存在大量的lncRNA。Arun等[14]研究发现lncRNA mrhl(meiotic recombination hot spot locous)能够通过它的蛋白伙伴Ddx5(DEAD-box helicase 5)对小鼠精原细胞Wnt信号产生负调控作用，当mrhl表达下调时，激活Wnt信号靶基因的转录，调节下游相关基因的表达，表现为促进精原细胞增殖、抑制分化。此外，Anguera等[15]发现lncRNA Tsx(Testis-specific X-linked)在小鼠精原细胞中高表达，敲除Tsx后发现精原细胞生长迟缓、分化差、细胞死亡率升高，说明Tsx在减数分裂过程中起重要作用，与精子发生密切相关。

2.2 miRNA对精子发生过程的调控

miRNA通过与靶mRNA 3'非编码区(untranslated regions，UTR)完全或不完全的互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制，在转录后水平负调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡。通过高通量测序研究发现在精原细胞、精母细胞和精细胞中有大量的miRNA选择性表达。He等[16]研究发现miR-20和miR-106a在小鼠精原干细胞中优先表达，进一步利用miRNA模拟物和抑制剂进行体外和体内功能检测，结果表明miR-20和miR-106a是精原干细胞更新的关键。还有一些miRNA被报道参与精原干细胞的的增殖和凋亡，Li等[17]发现miR-204通过靶向Sirt1(silent informa-tion regulator 1)调控奶山羊精原干细胞的增殖，Niu等[18]研究发现miR-34c在P53下游表达促进奶山羊精原干细胞凋亡。上述研究表明miRNA参与了维持精原干细胞的自我更新，调控精原干细胞的增殖和凋亡，提示miRNA对精子发生过程具有重要的调控作用。

2.3 piRNA参与精子发生过程

piRNA通过抑制转座子活性，有效维持了生殖细胞基因组的稳定性，保证了精子的正常发生。Piwi蛋白首次在果蝇中被发现，它对生殖干细胞干性的维持起重要作用[19]。Piwi蛋白家族主要有3个成员Miwi、Miwi2和Mili，piRNA通过与它们结合形成piRNA复合物在精子发生过程中发挥作用。Girard等[20]发现Piwi蛋白家族是无脊椎动物干细胞自我更新和雄性生殖细胞发育所必需的。小鼠的Piwi蛋白在睾丸中高表达，Miwi和Mili蛋白出现在小鼠精子发生的不同阶段[21]。Kuramochi-Miyagawa等[22]研究发现，在小鼠中敲低Mili后，粗线期精母细胞精子发生受阻，精细胞不能发生形变形成成熟的精子，Chuma等[23]研究发现，在小鼠中敲低Miwi2后，小鼠减数分裂受阻，生殖细胞数量显著减少。这提示piRNA对正常的精子发生过程具有调控作用。

2.4 其他ncRNA对精子发生的调控

小干扰RNA(siRNA)可以诱导转录后基因沉默，这种现象广泛存在于生物体内，RNA干扰是研究基因功能和基因治疗的一个重要工具。Song等[24]在小鼠雄性生殖细胞中发现有大量的内源性siRNA(endo-siRNA)表达。Zhang等[25]在猪的精子细胞中发现了一种转座子Line1特异性表达的endo-siRNA (L1-specific endo-siRNA)，它通过抑制Line1反转录活性来抑制早期胚胎发育。和内源性siRNA一样，外源RNA干扰技术也是研究基因功能和基因治疗的一个重要工具。目前，RNA干扰技术在生物学领域的运用十分常见。在小鼠精子发生的早期阶段，运用RNA干扰技术沉默Gfra1(glial cell line derived neurotrophic factor α1)基因，可以促进精原干细胞分化为精原细胞，而沉默Nodal基因则会抑制精原干细胞分化[26]。上述研究表明在雄性生殖细胞中存在大量的内源性siRNA，敲低某些基因的表达后，精原干细胞的分化、精子的发育和释放受到影响，这提示我们siRNA在精子发生过程中发挥重要作用。

3 与卵子发生相关的ncRNA

哺乳动物的卵子发生位于卵巢内，卵子发生包括增殖期、生长期和成熟期。在生长期结束之后，卵母细胞准备进行减数分裂，但卵母细胞不会自动进入成熟期，而是停滞在减数分裂前期I，在促卵泡激素、促黄体生成素等激素的共同作用下完成成熟过程。卵子发生和精子发生一样是一个连续且复杂的细胞增殖、分化过程，越来越多的研究发现ncRNA在卵子发生过程中参与调控雌性生殖细胞的增殖、分化等过程(表3)。

表3 ncRNA调控卵子发生Table 3 ncRNA regulates oogenesis

3.1 lncRNA参与的卵子发生过程

研究表明，lncRNA参与调控雌性卵泡发育的各个阶段，包括参与卵子发生、卵母细胞成熟、黄体形成和功能维持等。越来越多的研究发现lncRNA在雌性生殖细胞中发挥重要的调控作用。Wang等[27]发现在新生小鼠卵巢中GAS5(growth arrestspecific 5)高度表达，且在女性生殖干细胞和卵母细胞中也有表达，另外还发现GAS5可以促进女性生殖干细胞的增殖，促进其体外存活，抑制体外培养的女性生殖干细胞的凋亡。另外，有些lncRNA可以促进排卵、促进卵泡发育。李加宇[28]的研究结果显示在小鼠卵巢组织中lncRNA647、lncRNA147、lncRNA274相对特异性高表达，在8周龄雌鼠右侧卵巢转染这3个lncRNAs，发现转染lncRNA274后与对照组相比卵泡发育相关的基因表达上调，黄体数量也显著增加。此外，lncRNA可以维持妊娠。Nakagawa等[29]发现，敲除小鼠的Neat1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1)后，小鼠的卵巢黄体形成严重受损，血清中孕酮水平降低。上述研究表明lncRNA可以调控雌性生殖干细胞的增殖、凋亡，促进卵泡排卵、发育，对黄体形成和妊娠维持起重要作用，这也提示我们lncRNA在卵子发生过程中发挥重要的调控作用。

3.2 miRNA对卵子发生的调控

随着高通量测序技术的发展和应用，在多种哺乳动物中成功构建了miRNA谱，发现不同物种之间的miRNA存在表达特异性。Hossain等[30]发现在多个物种的卵巢中存在miRNA群，如miR-21，miR-126，miR-143等，这些miRNA可以通过调控激素合成影响卵泡发育，例如，在猪卵泡颗粒细胞中过表达miR-375后雌二醇的合成降低。另外，Xu等[31]发现在卵丘细胞中miR-378通过抑制芳香化酶表达使雌二醇的生成降低，过表达miR-378后，卵丘细胞的增殖受到阻碍，与增殖相关的基因(hyaluronate synthase 2、prostaglandin-endoperoxide synthase 2)和与卵母细胞成熟相关的基因(connexin 43、serum pepsinogen ratio)的表达降低。此外，miRNA的表达会影响卵母细胞发育。Lei等[32]发现将小鼠合成miRNA的关键基因Dicer敲除后，miRNA的表达受到限制，卵母细胞发育停滞。上述研究表明miRNA在卵巢中表达，可以通过调控激素合成间接调控卵泡发育，miRNA的表达对卵母细胞的正常发育是非常重要的。

3.3 piRNA对卵子发生的影响

piRNA最早在果蝇中发现，随后在线虫、斑马鱼、小鼠等动物中研究了它的生物学功能。AKKOUCHE等[33]敲除果蝇胚胎发育时期的piwi蛋白后发现卵巢中与piwi簇转录作用有关的组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化(H3K9me3)减少，piRNA的形成受阻，导致卵子发生过程受阻。另外，Gou等[34]研究发现piRNA对果蝇卵泡中的fascilins基因有沉默作用，可以抑制它的表达，使得卵巢中生殖细胞和体细胞间的异常粘结恢复到正常水平。另外，piRNA蛋白可以促进雌性生殖细胞发育。Kowalczykiewicz等[35]发现在性成熟母猪的生殖细胞中有piRNA蛋白表达，并与piRNA特异性结合抑制转录子活性。此外，Huntriss等[36]对女性生殖细胞中piRNA途径反转录转座子沉默的关键基因人配子体特异性因子1(GTSF1)进行追踪研究，发现GTSF1的表达在妊娠第8～21周时明显增加，卵原细胞进入减数分裂原始卵泡形成的第一阶段。上述研究表明piRNA参与了卵子发生过程并对该过程起重要调控作用。

3.4 其他ncRNA对卵子发生的调控

circRNA是一种新型RNA，它不同于传统的线性RNA，它是由基因内反向剪切作用形成的，大多数circRNA由外显子形成，少数circRNA来源于内含子及其片段。circRNA可以与miRNA竞争性结合，调控下游基因的表达。Tao等[37]在母山羊的卵泡中发现了1个新的circRNA，将其命名为circRNA_0008219，研究发现它参与了1个circRNA-miRNA-mRNA共表达调控网络，通过荧光素酶活性测定显示它与3个卵泡相关的miRNA作用来调节卵泡发育。现目前关于circRNA在卵子发生领域的研究较少，深度挖掘circRNA对卵子发生的作用有很大的发展前景。

4 与早期胚胎发育相关的ncRNA

受精卵发育生长后进行卵裂，经过桑椹胚期、囊胚期、原肠胚期形成早期胚胎细胞。在哺乳动物的早期胚胎发育过程中不同作用的基因和调控因子共同参与调控胚胎的生长发育。研究发现，ncRNA可以参与调控胚胎干细胞的自我更新、分化等过程以及调控不育症相关疾病的发生(表4)。

表4 ncRNA调控早期胚胎发育及不育症相关疾病Table 4 ncRNA regulates early embryonic development and infertility related diseases

4.1 lncRNA调控早期胚胎发育

lncRNA参与了多个生物学过程，显示出更多的组织或细胞类型特异性表达模式。目前，lncRNA对早期胚胎发育的调控主要体现在胚胎干细胞的分化和自我更新层面。胚胎干细胞中存在大量的lncRNA，大部分都可以调控胚胎干细胞的基因表达。Karlic等[38]发现在小鼠卵母细胞向胚胎发育过渡的过程中一些lncRNA发生了动态变化，大部分母源性lncRNA在合子基因激活之前被降解，一部分lncRNA在调节胚胎发育过程中起积极作用，一些lncRNA是哺乳动物早期胚胎发育的必要调节因子。lncRNA可以调控胚胎干细胞的自我更新、维持多能性。Lu等[39]发现在小鼠中敲低lncRNA SNHG3(Small Nucleolar RNA Host Gene 3)后，小鼠的胚胎发育受到影响。另外，Mo等[40]研究发现,DLK1-DIO3印迹位点lncRNA表达缺失与人胚胎干细胞神经分化潜能降低有关，当印迹位点的lncRNA正确表达时，胚胎干细胞才具有全能性。lncRNA Gtl2(gene trap locus 2)位于该印迹区域，仅在早期胚胎发育的桑椹胚期和囊胚期表达，Han等[41]研究发现,Gtl2最早在桑椹胚期表达，并随着胚胎分化为囊胚而逐渐局限于内细胞团，且在囊胚中敲低干细胞多能因子Oct4(octamer binding transcription factor 4)和Sox2(SRY-related high mobility group-box 2)后Gtl2的表达降低，表明Gtl2在早期胚胎发育和细胞分化中具有重要的调控作用。此外，lncRNA还可以调控胚胎干细胞的分化。Yin等[42]研究发现,在小鼠中lncRNA Haunt通过RA通路和HOXA通路调控胚胎干细胞分化的正常进行。这提示我们lncRNA对早期胚胎发育具有重要调控作用。

4.2 miRNA调控早期胚胎发育

大多数母源性基因都会受到miRNA的调控从而影响早期胚胎发育。Wang等[43]在小鼠中敲低Dgcr8酶后发现miRNA的产生受到阻碍，胚胎干细胞发育受到抑制，表明Dgcr8酶是对miRNA的产生必不可少的调控转录本。另外，miRNA可以参与调控受精卵的发育。Giraldez等[44]发现产生了1个母系合子突变体阻断了斑马鱼中所有miRNA的形成，通过体外注射预处理的miRNA恢复基因沉默，发现Dicer酶突变引发的卵母细胞和受精卵在胚胎发育过程中出现的缺陷得到恢复，说明了miRNA对早期胚胎的正常发育具有重要作用。此外，miR-135a可以直接扰乱受精卵的增殖，导致不能形成胚胎干细胞，早期胚胎发育停滞。miRNA可以促进胚胎干细胞增殖和自我更新。Card等[45]发现miR-302在人胚胎干细胞中高表达，其在原代和转化细胞系中通过靶向Oct4和Sox2促进S期细胞增加，而G1期细胞减少。这提示我们miRNA对早期胚胎发育有积极的调控作用。

4.3 其他ncRNA调控早期胚胎发育

tsRNA来源于成熟tRNA或tRNA前体，是一类非编码小RNA，它的表达和修饰具有组织和细胞特异性。tsRNA能够作为表观遗传因子，调控子代发育。Sharma等[46]发现在小鼠中tRNA-甘氨酸-GCC来源的tsRNA在胚胎干细胞和胚胎中抑制与内源性逆转录元件MERVL相关的基因，从而调控胚胎干细胞和胚胎中基因的表达。

许多研究发现，在精子发生和卵子发生过程中，ncRNA的异常表达与不育症相关疾病的发生有关。ncRNA对雄性不育症的调控作用主要是通过调控精子发生过程，对雌性不育症的调控作用主要是通过调控卵巢的功能。在畜牧业中，不育症的发生严重影响动物的后代产生以及行业的经济效益。在人类中，不育症也是一类很常见的疾病，关乎人类的健康和发展。因此，对配子发生相关疾病的深入研究具有重要意义，进一步研究ncRNA对这些疾病发生的调控作用有利于为不育症疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

5 展 望

ncRNA是近年来的一个研究热点，研究发现其在多种生物学过程中发挥调控作用。目前针对与配子发生相关ncRNA的大量研究发现其在配子发生和早期胚胎发育过程中发挥重要的调控作用，其异常表达会引发多种危害生殖健康的疾病，展现了其在精子发生、卵子发生以及早期胚胎发育过程中的重要性和调控机制的复杂性。目前的研究表明ncRNA可以通过调控生殖细胞的增殖、分化等过程发挥调控作用，越来越多的研究者开始关注ncRNA在生殖健康领域的调控机制和发挥的作用，这对更好的理解配子发生过程、对不育症相关生殖疾病的诊断和治疗具有重要意义。