酶联免疫分析法测定水产苗种中喹乙醇代谢物

梁娟，于盟盟，潘玉兰，马腾*，安萍，王芳

(1.日照市海洋与渔业研究院，山东 日照 276826；2.乳山市海洋与渔业监督监察大队，山东 威海 264500)

喹乙醇(Olaquindox, OLA)是一种非抗生素类抗菌促生长剂，具有良好的广谱抗菌效果[1]，同时还能促进蛋白质同化，极大地提高动物机体对饲料的转化率和利用率，缩短动物的生长周期[2]，被广泛应用于水产养殖的促进生长、抗菌治疗和水生动物疾病的预防[3]。20世纪90年代开始，国内外学者研究发现，OLA及其主要代谢产物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)具有明显的蓄积毒性、免疫毒性、遗传毒性和致畸性，不但对水生动物的健康造成威胁，而且通过食物链进入人体后会造成人体慢性中毒、产生耐药性，对人类健康造成致畸、致癌、致突变等潜在危害[4-5]。早在1998年，OLA就已经被欧盟禁止作为饲料添加剂[6]；原农业部第2638号公告也明确规定停止在食品动物中使用OLA；原农业部标准NY 5070—2002《无公害食品 水产品中渔药残留限量》[8]中规定OLA在水产品中不得检出。但该类药物价格低廉，抗菌促生长效果好，违规添加现象仍时有发生，严重危害人体健康。

OLA稳定性差，在动物体内代谢快，代谢产物多，其中绝大多数代谢产物稳定性差，不具备检测条件，而MQCA代谢过程长、残留量比较稳定，是国际食品法典委员会认定的OLA残留标示物[4,9]，也被国内渔业质量安全监管部门作为OLA残留的监控对象。

近几年来，关于MQCA的检测方法报道很多，经查阅文献[1,4-5,7,9-11]和现行有效标准[12-15]，液相色谱法和液相色谱—质谱串联法等大型精密仪器分析法为主流检测模式，检测集中在畜禽肉[5,10-11,13,16]、蛋类[9]、水产品[1-3,8,15,17-18]、牛、猪的肝脏、肌肉等动物组织[13]以及奶类[12]等食品相关领域，针对水产苗种中MQCA残留的检测方法未见相关报道。水产苗种作为一类特殊品种，其繁育周期短、季节性强，适合国内渔业质量安全监管部门监督抽查和执法的期限非常短，特别是虾、蟹等甲壳类苗种，适合销售的时间只有短短3～4 d。大型精密仪器分析方法灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确证方法。然而，水产苗种样品用大型精密仪器进行检测，受限于前处理技术复杂、检测过程耗时长、检测结果滞后等原因，国内渔业质量安全监管部门应对阳性样品执法销毁时，该苗种已流向养殖环节。此种情况，不但贻误最佳执法时机，而且从养殖源头造成水产品质量安全隐患。因此，建立一种准确、快速、简便的检测方法具有重要意义。酶联免疫法灵敏度高、特异性强，且操作简单、快捷，还能避免产生大量有机废液，具有对人体伤害和环境污染危险性小等优点，是目前MQCA残留定性、定量筛选的主要方法[2,18-19]，特别适用于多品种、大批量水产苗种中MQCA残留的快速批量筛查。

本试验以中国对虾(Penaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、刺参(Stichopusjaponicus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等常见苗种作为研究对象，在MQCA酶联免疫反应试剂盒的基础上，通过采取HCl溶液替代H2SO4溶液、纯水饱和正己烷脱脂除杂等措施对方法进行优化，以有效减少前处理过程中MQCA的损失，降低基质效应的影响，提高方法灵敏度和准确度，做出方法学论证，以实现对不同基质水产苗种中MQCA的高效、快速检测，旨在治理水产苗种繁育过程中使用违禁药物，为严厉打击违法行为提供及时的技术支撑，提高执法工作的时效性，确保渔业质量安全。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

MK3型微孔板酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；微量移液器、多道微量移液器，赛默飞世尔科技有限公司；PL202-L型电子精密天平，梅特勒托利多仪器上海有限公司；SHZ型水浴恒温振荡器，龙口市先科仪器公司；涡旋混合器，美国Talboys公司；DC-24型水浴氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司；10D经济型纯水仪，上海摩勒科学仪器有限公司；DNP-9002BS-III型电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；TG16-WS2台式高速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；96孔MQCA检测试剂盒，大连柏尔食品安全技术有限公司；去离子水；乙酸乙酯(AR)、正己烷(AR)，上海国药集团化学试剂有限公司；HCl(AR)、H2SO4(AR)，天津科密欧试剂有限公司。

1.2 样品

本研究以中国对虾、三疣梭子蟹、刺参、牙鲆等常见苗种为目标基体，分别用聚乙烯桶培育4种不同基质苗种的阳性样本和阴性样本作为试验对象。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制

将1.1中浓HCl与H2O按照1∶2(V/V)配制浓度为4 mol/L HCl溶液，浓H2SO4与H2O按照 1∶8(V/V)配制浓度为2 mol/L H2SO4溶液；将试剂盒自带浓缩复溶液用等体积的纯水稀释，配制样本复溶液；将试剂盒自带20倍浓缩洗涤液与纯水按照1∶19(V/V)稀释为1倍工作洗液。

1.3.2 样品制备与提取

挑出样品中饵料等杂质，用去离子水清洗、沥干，搅碎成糜状，充分混合均匀；准确称取样品(1.00±0.05) g置于25 mL聚丙烯离心管中，加入8.0 mL乙酸乙酯和1.0 mL H2O，振荡5 min；加入1.4 mL 4 mol/L HCl溶液，涡旋振荡30 s，(22.5±2.5)℃ 4 000 r/min离心5 min；移取4 mL上清液，置于10 mL聚丙烯离心管中，(55±0.5) ℃水浴氮气吹干；加入1.00 mL纯水饱和正己烷溶解干燥物，旋涡振荡30 s；加入1.00 mL样本复溶液，旋涡振荡30 s；(22.5±2.5) ℃ 2 000 r/min离心5 min；弃去上层，下层溶液供酶标仪检测。

1.3.3 试验方法

分别移取标准溶液和样本溶液各50 μL置于对应的板孔中，再按以上顺序依次加入50 μL酶标记物和50 μL抗体，轻敲微孔板边缘混匀1 min，用盖板膜盖板后，(22.5±2.5)℃避光孵育30 min；揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔及时加入洗涤液250 μL，轻敲微孔板边缘混匀1 min，将孔内液体甩干，重复洗板步骤4次，每次间隔15～30 s，最后一次洗板后，应使板尽量甩干并在吸水纸上倒扣、排干(排干后若有气泡，先用洗耳球吹破，再拍干)；依次加入50 μL底物缓冲液和50 μL TMB底物，轻敲微孔板边缘混匀1 min，用盖板膜盖板后，(22.5±2.5)℃避光孵育15 min；将板孔加入50 μL的终止液终止显色反应，轻敲微孔板边缘混匀1 min，稳定1 min后，450 nm上机测定(上机前30～40 min打开酶标仪，使仪器状态稳定)。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

ELISA试剂盒操作规范规定乙酸乙酯为提取剂。经查文献，样品中MQCA常用提取剂有甲醇[1]、乙腈[10]和乙酸乙酯[15]等有机试剂。本试验考察了3种有机试剂的提取效果：将添加浓度为10.0 μg/kg的加标样品，分别用甲醇、乙腈、乙酸乙酯进行提取。结果表明：用甲醇提取，提取液较为浑浊、干扰成分较多，不利于正己烷净化；乙腈有利于沉淀蛋白，有一定的净化作用，提取液澄清[10]，但回收率仅为46.3%～59.2%，可能是乙腈与水互溶，有机相与水相不能分层，提取液中含有较多水分，氮吹时间延长，导致样品中MQCA损失较多，影响回收率。用乙酸乙酯作为提取剂，4种不同基质样品回收率得到明显提高，为66.7%～73.4%。故本方法采用乙酸乙酯作为提取剂。

2.2 酸解试剂的优化

MQCA为有机强酸，极性较强，在动物体内通过共价键与蛋白质以结合状态存在，需将MQCA水解为游离态之后再对其进行提取。经查阅文献得知，有酸水解[11]、碱水解[5-6]和酶水解[17]等多种方法可供选择。酶水解过程温和但耗时长，需要16～18 h[6,10]，碱水解通常反应较为剧烈[5-6]，会造成MQCA降解。以这2种方式进行水解，后续还要加酸调节pH至酸性，样品净化处理过程烦琐，不能满足简单、快捷的需求。程春霞等[11]研究发现，采用酸水解的方式可有效沉淀蛋白质，减少杂质干扰，保证较高的提取效率[9,11]。因此，本研究选用酸水解方法。

ELISA试剂盒操作规范规定酸解液为1 mL浓度为2 mol/L H2SO4溶液，考虑到水产苗种样品是整只搅碎混匀[20]，其中蟹壳、虾壳和鱼骨中的CaCO3成分极易与H2SO4溶液反应生成CaSO4，CaSO4微溶于水，会包在样品颗粒表面，阻碍MQCA的充分提取，用HCl溶液进行酸解可有效避免这一现象。为验证这种可能性，本试验通过H+等摩尔浓度换算，将2 mol/L H2SO4溶液优化为4 mol/L HCl溶液，将 4种不同基质阴性样品各称取6份，均添加10.0 μg/kg加标水平，分别设置H2SO4溶液和HCl溶液2种酸解条件，每种条件3组平行(表1)。结果表明，酸解液由H2SO4溶液优化为HCl溶液后，除刺参苗种的平均检出水平差异不大外，其他3种苗种的平均检出水平明显提高。由此可见酸解试剂优化的必要性。

表1 不同酸解条件下MQCA的检出水平Tab.1 Detection level of MQCA under different acidolysis conditions

2.3 净化试剂的优化

水产品中含有丰富的维生素、糖类、色素、蛋白质、脂肪等物质，基质复杂[2,6,19]，且育苗水体中含有微生物制剂，水质粘性大，苗种体表清洗不彻底，导致样品化学成分复杂，乳化现象比较严重，基质效应增加。为有效解决这一问题，本研究用纯水饱和正己烷对样品进行净化，在去除脂溶性杂质的同时将水溶性杂质一并去除，达到良好的净化效果，以提高方法灵敏度和准确性。用MQCA阴性样品添加10.0 μg/kg加标水平，分别用正己烷试剂和纯水饱和正己烷去脂，每种去脂方式设3组平行，分别计算平均检出水平。结果如表2显示，用饱和正己烷去脂的样品检出浓度较高，基质效应明显降低，方法准确度和灵敏度得到提高。

表2 不同去脂条件MQCA检出水平比对Tab.2 Comparison of MQCA detection levels under different degreasing conditions

2.4 酸解条件的优化

在HCl溶液固定浓度为4 mol/L的试验条件下，本试验考察了不同HCl溶液添加量对样品中MQCA回收率的影响。称取4种不同基质阴性样品，均添加10.0 μg/kg加标水平，每种基质样品3组平行，HCl溶液添加量为1.0 mL条件下，做加标回收试验。试验结果显示，刺参苗种的回收率为74.3%，其准确度满足食品中禁用药物的质量控制要求[21]，中国对虾苗种和牙鲆苗种的回收率处于合格范围最低限值(60%)附近，三疣梭子蟹苗种回收率最低，只达到40.3%，考虑蟹壳、虾壳和鱼骨中的CaCO3成分与HCl溶液发生反应，影响了酸解效果。后续又将4种不同基质阴性样品分别称取5组，每组3个平行，均添加10.0 μg/kg加标水平。分别添加HCl溶液1.10、1.20、1.30、1.40和1.50 mL。如图1所示，在1.10～1.40 mL范围内，刺参苗种回收率依然无明显变化，其他3种苗种的平均回收率随着HCl溶液的增加而提高，1.40 mL时达到最大值；HCl溶液添加量为1.50 mL时，回收率与1.40 mL相比无明显差异。最终确定该方法HCl溶液的添加量为1.40 mL。

图1 HCl溶液不同添加量对MQCA回收率的影响Fig.1 Effect of different addition amount of HCl solution on MQCA recovery

2.5 线性范围及检出限

用本研究所建立的方法对样品进行前处理，采用试剂盒提供的MQCA标准溶液制作标准曲线，并使用试剂盒专业分析软件进行定量分析，在0.400～32.400 μg/kg范围内，MQCA呈良好的线性关系，标准曲线方程y=-18.193ln(x)+37.074，相关系数R2=0.996。考虑到渔业监管部门规定水产品中OLA残留限量为50.000 μg/kg，本研究将标准曲线的最高点质量浓度配制为60.0 μg/kg。结果表明，该方法MQCA在0.400 ～ 60.000 μg/kg范围内依然呈良好的线性关系。在4种不同基质阴性样品中添加MQCA标准溶液，在曲线最低浓度做加标回收试验，其回收率和精密度均能满足质量控制要求[21]。该方法样本稀释倍数为2倍，根据结果，确定此方法MQCA检出限为0.400 μg/kg，中国现行标准对水产品中OLA和MQCA的检出限分别为50.000 μg/kg[22]和4.000 μg/kg[15,17]，表明该方法的灵敏度较高，优于现行有效标准，能满足检测要求。

2.6 回收率与精密度

考虑到本方法只是筛选方法，阳性样品还需用原农业部1077号公告-5-2008[15]规定的HPLC法进行确证，以4种不同基质MQCA阴性样品作为空白基质，分别进行4.00、8.00和40.00 μg/kg的加标回收试验，每个加标水平设6组平行。按1.3对样品进行提取和测定，各基质样品的加标回收率均在71.4%～95.7%之间，精密度范围为3.9%～7.9%(表3)，3个不同加标水平均能满足回收率在60.0%～120.0%、精密度≤15.0%[21]的质量控制要求。

表3 MQCA加标回收率和精密度试验结果Tab.3 Results of adding standard recoveryand precision tests of MQCA n=6

2.7 实际样品检测

考虑到OLA及其MQCA在动物体内吸收、代谢、转化过程均需要一定的时间，试验开始前，分别培育4种不同基质苗种阳性样本作为试验对象，每种基质样品均称取2组，每组3个平行，分别用上述方法和HPLC法[15]进行测定。由试验结果(表4)得知，2种方法结果均为阳性，且相对偏差范围为5.7～14.9，满足实验室质量控制规范要求[15]。与HPLC法相比，ELISA法前处理操作步骤简单，上机时间明显缩短，能够较好地满足提高渔业质量安全监管部门执法时效性的需要。

表4 ELISA法和HPLC法测定MQCA结果比对Tab.4 Comparison of ELISA and HPLC results of MQCA

3 结论

本研究在MQCA酶联免疫反应试剂盒的基础上，对前处理过程进行优化改进，通过采取HCl溶液替代H2SO4溶液、纯水饱和正己烷脱脂除杂等措施优化样品前处理技术，建立了一种测定不同基质水产苗种中MQCA残留的检测方法，以期为水产品质量安全监管部门的快速执法提供技术支撑。通过试验验证和实际样品检测结果得知，中国对虾苗种、三疣梭子蟹苗种、刺参苗种、牙鲆苗种4种不同基质样品在0.400～60.000 μg/kg加标水平范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2=0.996，4.00、8.00和40.00 μg/kg 3个不同加标水平回收率为71.4%～95.7%，精密度为3.9%～7.9%，方法的准确度与精密度均满足药物残留分析的要求[21]。该方法具有前处理过程简单快速、结果可靠、适用性强、重现性好、灵敏度高等优点，适用于多品种、大批量水产苗种中MQCA残留的快速批量筛查，有效解决了检测结果滞后、执法时效性差等问题。运用灵敏度高、特异性强的酶联免疫法对大批量样品进行定性、定量盲筛，后续结合大型精密仪器对阳性样品进行确证，能够较好的满足渔业质量安全监管部门的需要，是目前水产苗种质量安全监督抽查中值得推广的方法。