不同循环次数凝胶用水的理化性质及其对油炸鲢鱼丸表面结构的影响

李晴，李雪宇，刘月月，马长伟，洪惠,2*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2. 中国农业大学兴化健康食品产业研究院，江苏 兴化 225700)

中国淡水鱼资源丰富，淡水鱼类的精深加工是中国渔业的重要发展方向[1]。鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)是中国的“四大家鱼”之一，2020年鲢的养殖年产量为381.29万t，仅次于草鱼[2]。鲢繁殖速度快，肉质鲜嫩美味且价格低廉[3]，但肌间刺多、土腥味重、鲜活售卖市场小，因此多被用来加工成鱼糜及鱼糜制品[4]。鱼肉经过采肉、漂洗、斩拌、擂溃、成型、凝胶化等一系列工艺可以形成具有一定弹性和质感的凝胶制品[5-7]。鱼丸是一种高蛋白、口感好、受众广的淡水鱼鱼糜凝胶制品[8-9]。油炸鱼丸作为休闲即食散装鱼丸的前身，深受消费者青睐，但是在工厂实际生产中，随着凝胶过程中循环水利用次数增加，鱼丸在油炸后常发生表面皱缩，出现孔洞和坑斑等劣化现象，影响鱼丸美观，不利于工厂鱼丸品质的维持和经济利益的提升。鱼糜在水中受热形成凝胶，凝胶用水指鱼糜经挤压从成球到形成鱼丸的凝胶化过程中所用的水。佘文海等[10]使用TRIZ(Theory of inventive problem solving)理论研究油炸鱼丸在定型环节表面杂质黏附问题，结果表明鱼糜在被连续挤压成型后进行凝胶化的过程中，凝胶用水中下降鱼丸与上浮鱼丸之间的碰撞以及切割产生的碎屑杂质不断溶解、积累，这些杂质颗粒会黏附在鱼丸表面，导致鱼丸在油炸过程中受热不均匀，影响表面性状。此外，循环凝胶用水中鱼丸组分的溶解与积累也会为微生物的生长繁殖提供有利条件，造成水质pH降低，从而影响鱼丸表面性状劣化[11-12]。但是，为解决油炸鱼丸表面性状劣变问题而不断更换工厂全生产线的清水会大大增加企业的生产能耗和成本。

因此，本研究立足于工厂实际生产中油炸鱼丸表面性状劣化问题，首先对油炸鱼丸生产线中的凝胶用水进行取样，测定凝胶过程中每次循环水的相关理化指标(pH、蛋白质含量和等电点)和最终成品鱼丸指标(色差及表面感官评价)，然后使用等电点沉淀法沉降循环水中的蛋白质，结合电泳和质谱分析确定其中主要的蛋白质种类。通过探究凝胶过程中循环水的理化性质及其对油炸鲢鱼丸表面结构的影响，可为解决实际生产过程油炸鱼丸表面性状劣变问题提供思路和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡水AA级白鲢鱼糜，购自江苏省兴化市大泽水产制品有限公司。乙酰化二淀粉磷酸酯(Acetylated distarch phosphate，ADSP)、复合磷酸盐，购自河南万邦实业有限公司；巴氏杀菌冰蛋清，购自苏州欧福蛋液股份有限公司；猪肥膘，购自北京市海淀区学清路物美超市；舒可曼白砂糖，购自广州福正东海食品有限公司；太太乐99度味精，购自上海太太乐食品有限公司；油炸香精，购自厦门市顶味兴业香料发展有限公司；精制食用盐，购自中盐上海市盐业有限公司；谷氨酰胺转氨酶(型号：TG-1)，购自泰兴市东圣生物科技有限公司；大豆分离蛋白，购自临沂山松生物制品有限公司；福临门一级大豆油，购自中粮福临门食品营销有限公司；N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(N,N,N′,N1*-Tetramethylethylenediamine, TEMED)、彩虹24plus广谱蛋白标志物、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、苯酚，购自北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝R250、牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、尿素、碘乙酰胺、磷酸三氯乙酯BondBreakerTMTCEP 溶液、胰蛋白酶、乙腈(色谱级)，购自Sigma-Aldrich公司；PierceTMQuantitative Colorimetric Peptide Assay Kit，购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 设备与仪器

FP3010食品加工机，德龙博朗家电有限公司；JYS-A950绞肉机，九阳股份有限公司；N4紫外-可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS ZEN3700纳米粒度和ζ电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；NR110精密色差仪，深圳市3NH科技有限公司；TA-XT2i质构仪，广州市博勒飞质构仪技术服务有限公司；Model TGL-16A台式高速冷冻离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；Seven2 Go手持pH计，梅特勒-托利多仪器制造有限公司；WGZ-2PJ 浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；SAVANT SPD1010台式快速离心浓缩干燥器、EASY-nano LC 1000液相色谱仪、Q ExactiveTMPLUS质谱仪、UltiMate制备液相色谱仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 工厂取样操作

工厂油炸鱼丸生产线的制作工艺流程主要为：冷冻鱼糜→刨片→绞碎→空擂→盐擂→混擂→出料→成型→凝胶成型(20 min左右)→热定型(3 min左右)→冷却沥水→油炸→冷却→成品油炸鱼丸。于工厂车间油炸鱼丸生产线上取样，从早晨第一批次开始凝胶即8点10分时取样，每隔1.5 h在凝胶槽固定位置取一批凝胶用水样品；从8点35分开始，每隔1.5 h在油炸线上取一批油炸鱼丸成品，各取7批，测定各批次凝胶用水和油炸鱼丸的相关指标。

1.4 实验室模拟工厂制作鱼丸

实验室模拟步骤如下：将冻存鱼糜经半解冻后切成片状，置于绞肉机中绞碎。将170 g绞碎的鱼糜置于擂溃机中，分别向其中加入0.34 g复合磷酸盐和0.68 g咸蛋清(食用盐∶蛋清蛋白=1∶19)。低速混合均匀至浆料稍有粘性，无硬颗粒。然后，向浆料中加入1.19 g食盐中速擂打3 min，再次加入1.19 g食盐并高速擂打8 min至浆料粘性较大、有光泽、基本无颗粒状。随后，在低速状态下，向浆料中加入1.19 g食盐、1.70 g味精、0.34 g谷氨酰胺转氨酶、3.40 g 55%糖水(v/w)和30.60 g肥肉乳化浆(大豆分离蛋白∶冰水∶肥肉=2∶12∶1)并高速搅打1 min后再加入1.53 g ADSP高速擂打2 min，制作期间加入8.50 g 冰水控制出料终温为0～5 ℃。使用800 mL蒸馏水作为凝胶水连续成型14批鱼丸(170 g鱼糜/批)，使料水比在1∶5左右。鱼丸的制作采用两步加热凝胶化法：43 ℃ 20 min+93 ℃ 3 min。加热完成后，捞出沥水，每批浆料成型约15粒鱼丸。每成型一批鱼丸后取出50 mL 43 ℃凝胶用水用于测定后续指标，再补充蒸馏水至800 mL进行下次凝胶化。待鱼丸冷却至室温后，置入155 ℃油锅中，油炸70 s后捞出。油炸鱼丸室温冷却2 h后用无菌均质袋封装，4 ℃冷藏保存。

1.5 凝胶用水指标测定

1.5.1 pH的测定

使用手持式pH计对各批次凝胶水样进行测定，各测定3次，取平均值。

1.5.2 等电点的测定

参考Tan 等[13]和程海明等[14]的方法，使用电位仪对各批次凝胶水样进行等电点测定，测定不同pH条件下体系ζ-电位的变化(凝胶用水pH的调节使用1%的柠檬酸及1%的氢氧化钠)，将不同pH条件下ζ-电位值的变化作一条曲线，当曲线ζ-电位值为0时，该点所对应的pH值即为体系等电点。每个pH体系测定3次ζ-电位值，取平均值。

1.5.3 蛋白质含量的测定

参照Torten等[15]的方法使用双缩脲法测定凝胶用水中蛋白质含量。

1.6 色差

使用手持式色差仪测定其L*、a*、b*值，其中L*为明度值，a*为红度值，b*为黄度值，每个批次取3颗鱼丸，每颗鱼丸表面取3个不同的位置进行测定，最终结果取平均值。

1.7 SDS-PAGE

用5%的柠檬酸将凝胶用水的pH调至等电点，沉淀其中蛋白质后离心、透析脱盐、冻干。将蛋白质重新溶解后，用双缩脲法测定蛋白质浓度，将浓度调整至2 μg/μL后，以3∶1(v/v)的比例与上样缓冲液混合后置于沸水浴加热10 min。取20 μL凝胶用水蛋白和同浓度的蛋清蛋白上样至SDS-PAGE(4%浓缩胶，10%分离胶)。在80 V电压下使样品通过浓缩胶，120 V电压下使样品到达分离胶底部。考马斯亮蓝R250染色SDS-PAGE 1 h后，用脱色液[25%乙醇 (v/v)和 8% 乙酸溶液(v/v)]脱色至底色接近透明，拍照保存[16]。

1.8 质谱鉴定

取100 mg蛋白冻干粉样品，用8 mol/L尿素将体积调节为100 mL。取0.1 mL蛋白溶液加入2 μL 0.5 mol/L的磷酸三氯乙酯，37 ℃下静置1 h，再向其中添加4 μL 1 mol/L碘乙酰胺，室温下避光反应40 min。再按样品∶丙酮为1∶5(v/v)的比例向其中加入-20 ℃预冷丙酮，-20 ℃静置过夜。随后在12 000 r/min, 4 ℃下高速离心20 min，弃去上清液。向沉淀中加入1 mL -20 ℃预冷丙酮，混匀，高速离心(12 000 r/min, 20 min, 4 ℃)后弃去上清，并重复2次。室温干燥至沉淀表面丙酮完全挥发，将其重新溶于100 μL 100 mmol/L 三乙胺-碳酸缓冲液中，按酶∶蛋白为1∶50(m/m)向其中加入胰蛋白酶，37 ℃过夜酶解。C18柱除盐后冻干。

将样品复溶于水后经Nano-HPLC-MS/MS鉴定凝胶用水中的蛋白质组成。样品上样量为3 μL(分析柱：Acclaim PepMap C18, 75 μm x 25 cm)，柱流量控制在300 nL/min，柱温为40 ℃，电喷雾电压2 kV，色谱梯度如表1所示(流动相A相：0.1% 甲酸水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液)。

表1 流动相梯度设置表Tab.1 Mobile phase gradient setting table

质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：MS：扫描范围(m/z)=350～1 800；分辨率=70 000； C-trap最大容量(AGC target)=3×106; 最大注入时间=50 ms；MS/MS：分辨率=17 500；C-trap最大容量(AGC target)=1×105; 最大注入时间=45 ms; 碰撞能量=28 eV。

设置搜库参数，串联质谱图用PEAKS Studio version X+ 软件分析。PEAKS DB对鲢、鸡肉和大豆3个数据库，名称分别为uniprot_Hypophthalmichthys_molitrix、Gallus_gallus、glycine_max进行搜库，设置条件为trypsin酶解。碎片离子质量容许误差：0.02 Da，母离子质量容许误差：7×10-6，最大漏切数：2[17]。

1.9 蛋清处理凝胶用水实验

设置6组凝胶用水：(1)未经任何处理的纯净水组；(2)pH调至4.35组；(3)添加20 g蛋清组(卵白蛋白浓度为 2 mg/mL)；(4)添加20 g蛋清调pH组(卵白蛋白浓度为 2 mg/mL，pH 4.35)；(5)添加40 g蛋清组(卵白蛋白浓度为 4 mg/mL)；(6)添加40 g蛋清组调pH组(卵白蛋白浓度为 4 mg/mL，pH 4.35)。分别用以上6组凝胶用水制作油炸鱼丸，并进行油炸鱼丸表面性状的感官评价。

1.10 感官评价

随机选取10粒不同批次的鱼丸，由9名受过专门培训的感官评定小组人员参照图1和表2的评价标准进行感官评价。

表2 油炸鱼丸的表面感官评价标准Tab.2 Standard of surface sensory evaluation of fried silver carp balls

图1 油炸鱼丸的表面劣化现象 (a)较优性状 (b)表面空洞 (c)表面皱缩Fig.1 Surface degradation of fried fish balls(a)superior properties (b) surface holes (c) surface shrinkage

1.11 数据统计与分析

使用Microsoft Excel 2019分析各项数据指标，结果使用平均值±标准差表示，显著性分析使用SPSS 21.0的单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 工厂和实验室生产过程中不同循环次数凝胶用水pH、蛋白质含量、等电点的变化

由图2(a)和(d)可知，工厂和实验室条件下的凝胶用水pH随着生产批次的增加而逐渐下降，工厂条件下pH由初始值7.25(第1批)逐步降至4.35(第7批)，实验室条件下凝胶用水的pH从第1批的7.10逐渐下降至第8批的6.89后趋于平缓。pH的迅速下降可能是因为凝胶用水中蛋白质、淀粉、油脂等营养物质的不断积累使得微生物繁殖产酸。张月美等[18]的研究表明pH会影响肌原纤维蛋白的聚集，在pH为6.00时肌原纤维蛋白可形成较好的凝胶结构。Tan等[19]的研究显示pH降低会破坏肌原纤维蛋白的二级和三级结构，暴露部分疏水基团，从而造成肌原纤维蛋白的聚集。由此推测pH的迅速下降可能会影响鱼丸表面肌原纤维蛋白的交联，使蛋白质-水相互作用减弱，蛋白质无法大面积展开，水分流失，表面性状劣化。图2(b)和(e)显示凝胶用水中的蛋白质浓度随着生产批次的增加而逐渐上升，但工厂中第5批和第6批之间的蛋白质含量呈现了显著下降。这可能是因为第5、6批凝胶用水的pH在4.50左右，达到了蛋白质等电点，从而造成蛋白质的絮凝，降低了水中蛋白质含量。如图2(c)和(f)所示，在一天的凝胶过程中，工厂凝胶用水的等电点在4.56浮动。研究表明，肌原纤维蛋白的等电点范围为5.00～5.20[20]，卵白蛋白在pH 4.50时到达等电点附近，卵转铁蛋白的等电点在6.50左右[21-22]，此时其溶解度最小，易沉淀析出。因此，凝胶用水中的蛋白可能是源于鱼丸中蛋清的卵白蛋白，但还需要通过凝胶电泳和质谱技术进一步鉴定。

图2 工厂和实验室条件下各批次凝胶用水的pH、蛋白质含量和等电点变化Fig.2 Changes in pH、the content of protein and isoelectric point of each batch circulating water of factory

2.2 实际生产过程中不同批次油炸鱼丸色泽、感官评价以及表面性状的变化

油炸主要是为了改善食品色泽以及风味，在高温油炸条件下，油炸食品表面发生美拉德反应，呈现出金黄色或棕黄色的诱人色泽，同时食物会吸附油炸中产生的风味物质，赋予食物特殊的炸制香味[23]。油炸期间，食品发生水油置换，水分蒸发、油分进入的过程导致食品表面干燥形成硬壳。如图3所示，随着生产批次的增加，油炸鱼丸的表面明度值先升高后降低，而红度值和黄度值均在前3批之后显著降低(P<0.05)，这表明在刚开始生产时，油炸鱼丸色泽较深，之后随着第3批鱼丸生产，凝胶用水的pH迅速降至5.00以下，油炸鱼丸的色泽也随之下降。而鱼丸的颜色在第6批时红度值和黄度值有显著升高(P<0.05)。这可能归因于第5批鱼丸生产后的凝胶用水中的pH趋于蛋白质等电点，导致蛋白质发生絮凝。由图4可知，随着凝胶用水循环利用次数的增加，工厂生产的油炸鱼丸的表面性状评分均呈现先增高后降低的趋势，第3批的整体表面评分最高。图5也显示，油炸鱼丸的表面孔洞和凹陷随着凝胶用水循环次数的增加而逐渐明显。鱼丸表面色差以及表面感官评分的变化趋势与pH值下降趋势相吻合，与循环水中的蛋白质含量相反，因此推测凝胶过程中，循环水的pH下降及蛋白质含量增加是影响油炸过程中油炸鱼丸表面上色情况以及表面感官性状的关键因素。

图3 工厂各批次油炸鱼丸的明度(a)、红度(b)、黄度(c)变化注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig.3 Changes in brightness(a)、redness(b)、yellowness(c) of each batch of fried silver carp balls of factoryNote：Different letters represent significant difference.

2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

如图6所示，凝胶用水中经等电点沉淀后的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)有4个丰度较高的条带，分别在17、36、42和75 kDa附近，其中在42 kDa的条带丰度最高，蛋清蛋白在42 kDa和75 kDa 的条带丰度较高。肖娜等[24]和吴烨婷等[25]的研究结果均显示卵白蛋白分子量45 kDa 左右，卵转铁蛋白分子量77 kDa 左右，因此凝胶用水中42 kDa 和75 kDa的条带可能为卵白蛋白和卵转铁蛋白，但还需进一步质谱鉴定。

图5 实验室各批次鱼丸油炸后的表面性状Fig.5 Surface properties of each batch of fried silver carp balls of laborary

图6 凝胶用水中沉降蛋白和蛋清中蛋白的SDS-PAGE分析图Fig.6 SDS-PAGE analysis of protein in circulating water and egg white

2.4 质谱分析

经前期质控后筛选出999种可能存在的蛋白质，结合SDS-PAGE电泳结果(图6)，筛选出峰面积>1×109且分子量在17、36、42和75 kDa附近的蛋白，结果如表3，其中卵白蛋白峰面积为4.69×1010，肽段含量为236，特殊肽段覆盖率高达99%；2种卵转铁蛋白峰面积分别为6.78×109和1.92×109，肽段含量分别为118和117，特殊肽段覆盖率分别为80%和77%。以上结果表明，凝胶用水中积累的蛋白质主要是鱼丸中溶出的卵白蛋白。蛋清是制作鱼糜制品的常用外源添加物，可以辅助增强鱼丸的弹性和质构特性[26]。卵白蛋白是蛋清的主要蛋白之一，约占蛋清蛋白总量的54%。研究表明，卵白蛋白可能是决定油炸鱼丸表面结构特性的关键蛋白[27]。鱼丸凝胶结构是否稳定主要与蛋白变性和聚集的相对速率有关，当蛋白质展开速度超过聚集速度时易形成细密的网络结构，而当其聚集速率超过展开速率时则会偏向于形成较为粗糙的、蛋白排列杂乱的凝胶结构[28]。随着凝胶过程中循环水利用次数的增加，卵白蛋白溶出量不断增多，鱼丸表面的蛋白组成和结构发生改变。高温油炸条件下导致鱼丸表面水分大量流失，从而形成孔洞和发生皱缩。

2.5 蛋清处理凝胶用水验证实验

为验证含有卵白蛋白和低pH凝胶用水对油炸鱼丸表面性状劣化的影响，用添加了蛋清和调低pH的凝胶用水制作鱼丸并对鱼丸表面性状进行感官评价来判定鱼丸表面性状劣化程度，结果如图7所示。在凝胶用水中添加蛋清和调低pH都会引起油炸鱼丸表面性状的劣化，导致油炸鱼丸表面孔洞、开裂、皱缩，使色泽评分以及整体表面评分降低。蛋清添加量越高，评分越低。其中，添加40 g蛋清组的表面孔洞最多，表面皱缩程度最大，且整体表面评价最低。与纯净水pH 7.00组相比，调节pH至4.35组整体表面评分显著降低，这表明pH降低会导致油炸鱼丸表面形成孔洞和产生开裂现象，降低表面色泽。因此认为在凝胶用水中添加蛋清或者降低pH确实会造成油炸鱼丸表面性状劣化，使得鱼丸发生表面孔洞、皱缩、开裂现象，影响其感官品质，降低油炸鱼丸的产品质量[29-30]。

表3 凝胶用水中蛋白质谱分析结果Tab.3 Results of protein mass spectrum analysis in circulating water

图7 不同处理组油炸鱼丸表面感官评价结果对比Fig.7 Comparison of surface sensory evaluation of fried silver carp balls in different treatment groups

3 结论

本研究为解决循环凝胶用水生产鱼丸油炸后表面劣化问题，在实验室条件下模拟工厂中油炸鱼丸生产过程，证实了凝胶用水中的蛋白含量和pH降低可能是造成鱼丸表面劣化的关键因素，利用SDS-PAGE和质谱技术，确定了循环凝胶用水中的蛋白主要是源于蛋清的卵白蛋白。这为解决油炸鱼丸生产企业产品表面性状劣化问题提供了理论支持。为解决这一问题，未来鱼丸生产企业可以考虑通过降低蛋清使用量、寻找蛋清蛋白替代品以及在生产过程中实时调节凝胶用水pH的方式来改善油炸鱼丸后期的表面劣化现象。