FOS 样抗原1 修饰间充质干细胞移植促进缺血肢体血管新生的实验研究

张婉，高斌，符伟国，史振宇

1. 复旦大学附属华东医院血管外科，上海 200040；2. 复旦大学附属中山医院血管外科，上海 200032

周围动脉疾病（peripheral artery disease， PAD）是由于系统性动脉粥样硬化斑块的形成导致动脉狭窄、闭塞等病理改变，最终出现远端组织供血不足，临床上以下肢动脉疾病多见。 全球范围内的PAD 患者超200 万例，多见于老年人群［1］， 70岁以上人群患病率高达 15%～20%［2］。 当 PAD 患者出现足部静息痛、坏疽或溃疡（病程＞2 周）时，临床上即可诊断为重度肢体缺血（critical limb ischemia， CLI）［3-5］。 CLI 是 PAD最危重的类型，这类患者多合并糖尿病或肾功能不全，膝下流出道条件非常差［6］，常失去血运重建机会，这类“无重建选择”的CLI 患者往往面临大截肢、心血管不良事件和死亡风险［3-5］。

治疗性血管新生指的是将基因技术与细胞移植有机结合，促进血管新生，改善缺血区域血流灌注［7］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是多能干细胞，具有可塑性强、自我更新快、快速形成克隆等特征。 MSCs 是目前常用的治疗性血管新生种子细胞，为“无重建选择”的CLI 患者带来了保肢和生存的希望［7-13］。 但移植环境往往非常恶劣， MSCs 存活率低，严重影响移植效果。 研究证明， MSCs 内基因过表达可以增强种子细胞的生物学性能，继而提高移植性能［14-17］。 前期研究［18］证实 FOS 样抗原 1（FOS-like antigen 1，FOSL1）基因修饰的MSCs 增殖与迁移能力增强，因此本研究通过构建免疫缺陷小鼠动脉缺血模型，观察FOSL1 修饰MSCs 体内移植对缺血肢体血管新生能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株前期研究冻存的MSCs 细胞株和FOSL1基因修饰的 MSCs 细胞株［18］。

1.2动物6 ～8 周龄 SPF 级雄性 NOD-SCID 免疫缺陷小鼠30 只，体质量（25 ±5）g，购自复旦大学实验动物科学部。

1.3 试剂一抗／二抗兔抗大鼠CD34 抗体、一抗兔抗大鼠成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2， FGF2）抗体、一抗兔抗大鼠肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF）抗体、一抗兔抗大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）抗体、一抗兔抗大鼠血小板内皮细胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1， PECAM-1）／CD31抗体（武汉博士德生物工程有限公司，货号分别为BA0532、 A00121-2、 BA0911、 A0045、 BA2966）。 二抗羊抗兔IgG 抗体、二抗Cy3 羊抗兔IgG 抗体（美国Jackson 公司，货号分别为 85216、 94600）。 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记抗兔／抗小鼠二抗（上海威奥生物科技有限公司，货号WB0177、WB0176）。 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海威奥生物科技有限公司，货号WB0123）。

1.4 仪器电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）、倒置相差显微镜（美国Olympus 公司）、荧光显微镜（美国Olympus 公司）、小型 Trans-Blot 转印槽（美国Bio-Rad 公司）、组织匀浆器（北京鼎昊源科技有限公司）、超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物仪器有限公司）、冰冻／石蜡切片机（德国Leica 公司）和激光散斑衬比分析（laser speckle contrast analysis，LASCA）成像仪（瑞典Perimed 公司）等。

1.5方法

1.5.1 缺血模型建立 2% 戊巴比妥（50 mg／kg）腹腔麻醉，小鼠后肢外旋位，备皮和消毒右腹股沟区域。术前通过LASCA 分析测得小鼠双侧肢体血流灌注指数差值／双侧肢体血流灌注指数平均值＜5%。 纵行切开腹股沟韧带，逐层切开皮肤和皮下组织。 暴露股动脉鞘，完整游离股动脉（长约1 cm），在其两端结扎后切除。 肉眼直视下确认血流消失，局部注射青霉素预防感染。 术后2 h， LASCA 测得造模侧肢体血流灌注指数＜健侧肢体血流灌注指数的25%即为造模成功。

1.5.2 细胞培养 复苏 MSCs 细胞和FOSL1 基因修饰的 MSCs 细胞［18］，传代至 24 孔培养板中。 更换转染液后于37 ℃培养箱孵育， 24 h 后更换新鲜培养液继续培养 48 h。 0.1 μg／mL 嘌呤霉素培养液培养 1周，细胞扩增、传代至P3 代进行实验。

1.5.3 体内移植与分组 重悬上述2 种细胞至密度为1 ×106／mL，造模后 3 h 向小鼠造模侧肢体小腿腓肠肌注射1 mL 细胞混悬液或PBS， 5 个注射点，每2点间隔0.1 cm，每个注射点 0.2 mL。 实验分为 PBS组（n＝ 10）、 MSCs 组（n＝ 10）与 FOSL1 组（n＝ 10）。转染绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）标记移植细胞。

1.6 免疫荧光染色体内移植后第2 天，取小鼠造模侧肢体腓肠肌组织，制成切片厚度10 μm 的冰冻切片。 甲醛固定 5 min 后， PBS 清洗 3 次。 山羊血清封闭液封闭 30～60 min，弃封闭液。 CD34（1∶100）一抗4 ℃过夜， IgG（1∶500）二抗 37 ℃避光 2 h。 DAPI 复染， PBS 清洗3 次，于荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

1.7 免疫组化染色体内移植后第14 天，取小鼠造模侧肢体腓肠肌组织，制石蜡切片。 3%双氧水室温孵育5 ～10 min，蒸馏水和PBS 清洗，山羊血清封闭，室温下孵育10 min。 PECAM-1（1∶200）一抗 4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次。 IgG（1∶500）二抗37 ℃孵育30 min， PBS冲洗3 次。 HRP 标记链霉卵白素， 37 ℃孵育 30 min，PBS 冲洗3 次。 DAB 显色，冲洗后复染，显微镜下记录平均每肌纤维周围的微血管数，即微血管与肌纤维（capillary／muscular fiber， C／MF）比值。

1.8 Western blot体内移植后第14 天，取小鼠造模侧肢体缺血腓肠肌组织100 mg，获取VEGF、 FGF2 和HGF 蛋白提取液， BCA 法测蛋白浓度。 制备上样缓冲液，恒压电泳30 min 后转膜，5%BSA 室温封闭2 h。VEGF（1∶1 000）、 FGF2（1∶400）和 HGF（1∶400）一抗4 ℃冰箱过夜， HRP（1∶2 000）二抗室温孵育 2 h，化学发光检测试剂作用2 min 后显影。

1.9 血流灌注指数分别于体内移植后第1、 7、 14天，通过LASCA 评估后肢血流灌注指数，重复3 次取平均值。 灌注指数＝（造模侧肢体血流／健侧肢体血流） ×100%。

1.10 统计分析采用SPSS16.0 软件对数据进行分析。 符合正态分布的计量资料采用均数 ± 标准差（）表示，3 组间的两两组间比较通过重复测量的方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型构建与缺血症状观察通过完全结扎小鼠右侧股动脉构建小鼠缺血模型，肉眼即刻观察到造模侧肢体无血流灌注。 LASCA 分析造模前肢体血流丰富，2 h 后造模侧肢体几乎观察不到血流灌注，肢体颜色呈深蓝黑色，确定造模成功。 术后短期小鼠精神淡漠，肢体蜷缩，纳差。 造模侧肢体冰冷，严重者趾甲发黑、坏疽或自体截肢。 体内移植后第7 天，小鼠后肢冰冷与趾甲发黑逐渐改善，但前肢受力，活动缓慢且谨慎。 体内移植后第14 天，小鼠进食增加，趾甲发黑好转，四肢肌力增加，但仍存在活动不协调。 见图1。

图1 模型构建与缺血症状观察

2.2 体内移植后MSCs 的分化情况体内移植后第2 天，荧光显微镜下观察到GFP 阳性细胞分散于腓肠肌组织周围或融合在肌间隙血管周围。 FOSL1 组与MSCs 组可见少量GFP 与CD34 双阳性细胞。 见图2。

图2 免疫荧光实验结果（ ×20）

2.3 缺血肢体C／MF 比值体内移植后第14 天，与PBS 组（0.47 ±0.10）比较， MSCs 组（1.40 ±0.20）和FOSL1 组（1.95 ± 0.28）C／MF 比值均升高（均P＜0.05）；与 MSCs 组比较， FOSL1 组 C／MF 比值升高（P＜0.05）。 见图 3。

图3 免疫组化实验结果（ ×200， n ＝5）

2.4 MSCs 的促血管新生能力体内移植后第14天，与 PBS 组比较， MSCs 组的 FGF2、HGF 和 VEGF表达水平升高（P＜ 0.05）， FOSL1 组的 FGF2、 HGF和 VEGF 表达水平升高（P＜0.05）；与 MSCs 组比较，FOSL1 组的 FGF2、 HGF 和 VEGF 表达水平升高（P＜0.05）。 见图 4。

图4 Western blot 实验结果（n ＝3）

2.5 3 组血流灌注指数比较体内移植后第1 天， 3组造模侧肢体均无明显血流。 体内移植后第7 天，MSCs 组与FOSL1 组可见少量动脉血流灌注，血流恢复程度均优于 PBS 组（P＜0.05）。 体内移植后第 14 天，FOSL1 组血流恢复程度优于 MSCs 组（P＜ 0.05）；PBS 组血流灌注虽较体内移植前有所缓解，但血流恢复不及其余2 组。 见表1。

表1 3 组血流灌注指数比较（%）

3 讨论

目前，干细胞移植存在的困境是MSCs 体内移植环境恶劣，严重降低了移植疗效［19］。 Li 等［14］发现，在缺氧状态下MSCs 过表达Bcl-2基因后抗凋亡与旁分泌能力提高，进一步移植于大鼠心肌梗死模型的缺血组织后，能促进梗死区域的毛细血管密度与梗死面积恢复。 本次研究构建免疫缺陷小鼠肢体缺血模型，在缺血肌肉组织直接注射MSCs，并通过免疫组化和体内实验观察移植效果。

MSCs 体内移植后促进血管新生的机制，主要包括直接分化为内皮细胞和旁分泌VEGF、 FGF2 等促血管生成细胞因子，间接促进内皮细胞的生成［20-22］。 过表达HIF-α基因促进MSCs 细胞分泌细胞因子VEGF，能增强内皮细胞的成管功能与迁移功能［23］。 此次研究通过免疫荧光染色明确MSCs 是否在体内分化为内皮细胞。移植前，通过基因转染技术对移植细胞转染GFP，以便进行细胞体内追踪。 CD34 是一种内皮标志物，荧光镜下证实少部分移植细胞出现双阳性（GFP 与CD34）表现， MSCs 在缺血组织存活并向缺血区域分散，且有少部分MSCs 向血管内皮细胞分化，参与血管新生。 进一步通过蛋白免疫印迹检测发现，促血管生成因子在FOSL1 组与 MSCs 组的表达均高于 PBS 组，提示FOSL1 修饰的MSCs 分泌细胞因子的能力更强。

MSCs 移植后通过观察缺血症状、检测C／MF 比值和LASCA 技术来评估侧支循环是否有效建立。 移植后14 d 内，肉眼观察小鼠缺血症状存在一定程度缓解。 但该方法较为主观，进一步使用LASCA 技术客观判断［24］缺血肢体血流灌注情况。 移植后第7 天， FOSL1 组与MSCs 组的血流灌注指数差异不明显。 移植后第14 天，FOSL1 组的血流灌注指数优于MSCs 组。 这些改变与大体观察到的缺血症状改善趋势基本一致。 移植后第14 天，通过免疫组化实验观察微血管密度，结果显示FOSL1 组 C／MF 比值高于 MSCs 组。 提示移植FOSL1基因修饰的MSCs 有着更强的促血管新生能力。

本研究仍存在一定的缺陷：（1）FOSL1 基因与MSCs 的研究少见，此次实验结果初步证实了FOSL1促进MSCs 的旁分泌功能，但体内分子机制仍待进一步探究； （2）MSCs 本身存在致癌风险［25］，后续研究应更重视MSCs 的移植安全性，深入探讨分子机制。

综上所述，与单纯MSCs 移植相比，FOSL1 基因转染的MSCs 具备更强的旁分泌功能，能更有效地改善缺血肢体的血流灌注，促进血管新生。