胰腺癌患者BZW1 和BZW2 表达水平及其与预后的相关性分析

漆处梅，唐小龙

（1.达州市妇女儿童医院检验科，四川 达州 635000；2.滨州医学院第一临床医学院，山东 滨州 256600）

胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），通常称为胰腺癌（pancreatic cancer，PC）。目前，胰腺癌仍然是最致命的癌症类型之一[1]，预计其发病率会持续增加，到2030 年将成为癌症相关死亡的第2大常见原因[2]。由于诊断晚、转移早、对化疗或放疗反应有限，因此死亡率并未明显下降[3]。手术切除后的辅助化疗通常是治疗早期胰腺癌的首选方案，尽管化疗药物联合治疗可显著改善晚期胰腺癌患者的预后，但耐药的出现仍导致结局较差[3]。因此，胰腺癌新型预后标志物的再挖掘及鉴定是合理评估胰腺癌患者预后的关键点。为更加全面了解胰腺癌患者的预后状况，从而提高治疗效果，近年来在表达谱的广泛应用下，大量的基因组和转录组学数据得以积累，对其进行深度的挖掘和解读，无疑是推动医学发展的一项重要手段。由美国国家癌症研究所和美国人类基因组研究所共同开发的大型肿瘤研究项目-癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA），其利用高通量和多组学的肿瘤基因组分析技术，加深人类对肿瘤的认知，提高肿瘤的预防、诊断和治疗。基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库包含了838 个捐赠者和17 382 个来自52 个组织和两个细胞系的样本，均为正常组织的测序结果。因此，联合GTEx 数据库分析可弥补TCGA 数据库中正常组织少的缺陷，从而提高差异分析结果的准确性。基本亮氨酸拉链和含W2 结构域的蛋白质1 和2（Basic leucine zipper and W2 domain-containing proteins 1 and 2，BZW1 和BZW2）在维持启动密码子选择的稳态严格性方面具有重要作用[4]。然而，有报道称[5，6]，BZW1 和BZW2 的过表达与肺腺癌的不良预后有关。除此之外，BZW1 促进前列腺癌细胞的增殖及卵巢癌细胞迁移和侵袭[7，8]。BZW2 通过调控不同的信号通路可促进肝细胞癌和骨肉瘤等疾病的进展[9，10]。目前，尚未报道关于BZW1或BZW2 在胰腺癌中的作用，本研究通过整合生物信息学手段，构建分子蛋白网络并鉴定BZW1 和BZW2 涉及的生物学功能；其次，进一步利用TCGA和GTEx 数据库，鉴定BZW1 和BZW2 是否为胰腺癌患者潜在的预后标志物，以期为胰腺癌的发生发展调控机制提供一些科学依据。

1 材料与方法

1.1 资料来源 截至2021 年12 月，提取TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）中4 名健康人和178 例胰腺癌患者的RNA-seq 数据和对应的临床信息以及GTEx 数据库（https://www.gtexportal.org/）中167 名健康人胰腺组织的RNA-seq 数据。根据BZW1 和BZW2 表达量的中位数将胰腺癌患者分为BZW1 和BZW2 高、低表达组。缺失或未知的临床特征被认为是缺失值。

1.2 方法

1.2.1 数据处理 在TCGA 数据库中下载转录组表达数据及相应的临床信息，将数据格式从HTSeq FPKM 转化为TPM 进行后续的分析。GTEx 数据库中TPM 格式的RNA-seq 数据来自于经Toil 流程统一处理的UCSC XENA 数据库（https://xenabrowser.net/datapages/）[11]。此外，在所有分析之前对RNA-seq 数据进行了log2转换。

1.2.2 受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）判断BZW1 和BZW2 在肿瘤及正常组织中的预测准确性。其中，胰腺癌组织178份，健康胰腺组织171 份，并利用R 包“pROC”进行分析和R 包“ggplot2”进行可视化。

1.2.3 时间依赖ROC 曲线 分析BZW1 和BZW2 的表达与时间相关的结局的预测效能，利用R 包“timeROC”进行分析和R 包“ggplot2”进行可视化。

1.2.4 蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）提取与BZW1 和BZW2 相互作用的基因并通过STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）构建一个交互评分为0.400 的PPI 网络。然后，将STRING 中的数据导入Cytoscape 软件中进一步的美化图片。

1.2.5 京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本体论（gene ontology，GO）富集分析 通过KEGG 和GO 功能富集分析确定BZW1，BZW2 及其共表达基因的独特生物学特性，并使用R 包“clusterProfiler”进行分析。KEGG 用于相关途径的富集，而GO 用于识别独特的生物功能，包括生物过程（biological processes，BP）、细胞成分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）。

1.2.6 免疫浸润分析 肿瘤微环境中免疫细胞的相对浸润水平采用R 包“GSVA”中的ssGSEA 算法进行量化，这24 种免疫细胞的具体标记和分类已在Bindea G 等[12]发表的论文中确定。

1.2.7 Kaplan-Meier 生存分析 提取TCGA 数据库中的178 例胰腺癌患者进行生存分析，利用R 包“survival”对BZW1 和BZW2 高、低表达组的患者进行总生存期（overall survival）、疾病特异性生存期（disease specific survival）和无进展间期（progression free interval）分析，利用R 包“survminer”进行可视化。

1.3 统计学方法 所有统计分析在R Studio 软件上完成。计量资料以（）表示，比较采用t检验；计数资料以（n）表示，比较采用χ2检验和Wilcoxon 秩和检验；相关性分析采用Spearman 法；Kaplan-Meier生存分析采用Cox 回归分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BZW1 和BZW2 在胰腺癌组织中的表达及诊断效能 表达差异分析显示，BZW1 和BZW2 在胰腺癌组织中的表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1A。为了明确BZW1 和BZW2 对胰腺癌组织和正常胰腺组织的鉴别价值，ROC 曲线分析显示，BZW1 和BZW2 的曲线下面积（AUC）和95%置信区间（CI）分别为0.974（0.954～0.994）和0.944（0.918～0.970），见图1B。时间依赖ROC 曲线分析显示，BZW1 的表达预测胰腺癌患者1、3、5 年总生存期的概率分别为0.611、0.673、0.825，见图1C；此外，BZW2 的表达预测胰腺癌患者1、3、5 年总生存期的概率分别为0.623、0.584、0.601，见图1D。

表1 BZW1 和BZW2 在胰腺癌组织中的表达比较（）

表1 BZW1 和BZW2 在胰腺癌组织中的表达比较（）

图1 BZW1 和BZW2 在胰腺癌中的表达及诊断效能

2.2 BZW1 和BZW2 的生物学功能 利用STRING 数据库构建一个由18 个节点和41 条线组成的PPI 网络，并利用Cytoscape 软件进行PPI 网络美化（图2A）。为了进一步验证这些共表达基因在胰腺癌中的相关性，利用TCGA-PAAD 数据库中的RNA-seq数据绘制了相关性热图，发现这些基因具有相关性（图2B）。最后，将共表达基因进行GO 生物学功能富集分析和KEGG 途径富集分析，其中GO 分析显示这些基因主要定位于细胞核膜上，具有翻译启动因子活性，参与细胞质翻译起始复合物的形成；KEGG 分析显示这些基因主要参与RNA 的运输和mRNA 的监测（图2C）。

图2 BZW1 和BZW2 的生物学功能

2.3 BZW1 和BZW2 的表达与免疫浸润细胞的相关性分析 BZW1 与Th2 细胞（r=0.589，P＜0.05）、T 辅助细胞（r=0.381，P＜0.05）、Tcm 细胞（r=0.264，P＜0.05）、Th1 细胞（r=0.227，P＜0.05）、中性粒细胞（r=0.193，P＜0.05）和巨噬细胞（r=0.161，P＜0.05）呈正相关，而与pDC 细胞（r=-0.381，P＜0.05）和Th17 细胞（r=-0.185，P＜0.05）呈负相关（图3A）。BZW2 仅与Th2 细胞（r=0.420，P＜0.05）呈正相关，与NK 细胞（r=-0.381，P＜0.05）、TFH（r=-0.380，P＜0.05）、pDC（r=-0.353，P＜0.05）、肥大细胞（r=-0.317，P＜0.05）、细胞毒性细胞（r=-0.281，P＜0.05）、iDC 细胞（r=-0.269，P＜0.05）、B 细胞（r=-0.218，P＜0.05）、T 细胞（r=-0.215，P＜0.05）、CD8T 细胞（r=-0.214，P＜0.05）、嗜酸性粒细胞（r=-0.193，P＜0.05）、树突状细胞（r=-0.168，P＜0.05）、Tem 细胞（r=-0.168，P＜0.05）呈负相关（图3B）。NK CD56dim 细胞、中性粒细胞、T 辅助细胞、Tcm 细胞、Th1 细胞和Th2 细胞在BZW1 高表达组中富集更多，而pDC 细胞富集于BZW1 低表达组（图3C）。BZW2 高表达组中的Th2 细胞富集分数高于低表达组，而T 细胞、pDC 细胞、NK 细胞、肥大细胞、iDC 细胞、细胞毒性细胞、CD8T 细胞、B 细胞和TFH 细胞富集于BZW2 低表达组（图3D）。

图3 BZW1 和BZW2 的表达与免疫浸润细胞的相关性分析

2.4 BZW1 和BZW2 的表达与临床病理特征的关系在TCGA 数据库中共纳入178 例胰腺癌患者，但由于部分患者临床信息的缺失，每个病理特征分组的具体患者情况见表2。高表达BZW2 与T 分期（T3&T4 vs T1&T2）、M 分期（M1 vs M0）、肿瘤分期（Ⅱ～Ⅲ期vs Ⅰ期）和病理分级（G3&G4vs G1&G2）有关，而高表达BZW1 仅与主要治疗结果有关（P＜0.05）。此外，胰腺癌患者的N 分期、残余瘤状态、年龄和肿瘤部位与BZW1 和BZW2 的高、低表达无关（P＞0.05），见图4。

表2 BZW1 和BZW2 的表达与临床病理特征的关系（n）

表2 （续）

图4 BZW1 和BZW2 的表达与临床病理特征的关系

图4 BZW1 和BZW2 的表达与临床病理特征的关系（续）

2.5 BZW1 和BZW2 的高表达与胰腺癌患者的不良预后的关系 单因素Cox 回归分析显示，BZW1 和BZW2 是影响胰腺癌患者总生存期的独立风险因子，见表3。Kaplan-Meier 生存分析显示，与低表达BZW1 的胰腺癌患者相比，高表达BZW1 的患者具有更短的总生存期（19.7 个月vs 23.4 个月，P=0.013）、疾病特异生存期（P=0.007）和无进展间期（12.6 个月vs 18.9 个月，P=0.003）（图5A～图C）。另外，高表达BZW2 的胰腺癌患者同样具有更短的总生存期（17.2个月vs 23.2 个月）和无进展间期（13.1 个月vs 17.5个月）（图5D、5F）。然而，BZW2 的表达量的高低与胰腺癌患者的疾病特异生存期无差异，见图5E。

图5 BZW1 和BZW2 的表达与胰腺癌患者不良预后的关系（续）

表3 胰腺癌患者OS 的单因素Cox 回归分析

图5 BZW1 和BZW2 的表达与胰腺癌患者不良预后的关系

3 讨论

胰腺癌恶性程度高，预后极差，且5 年生存率约为5%[1]。目前，AJCC 分期是最有效的胰腺癌预后预测工具。此外，分子预后标志物可作为AJCC 分期的有益补充，进一步提高预后预测的准确性对提高胰腺癌患者的生存具有重要意义[13]。到目前为止，预测胰腺癌预后的生物标志物有限，因此筛选和鉴定与胰腺癌预后相关的分子标志物对了解胰腺癌的发展过程至关重要，并为改善癌症的临床管理提供新的机会。虽然已有表明BZW1 和BZW2 在各种癌症类型中的具有重要临床意义，但迄今为止BZW1 和BZW2 在胰腺癌中的作用报道较少。因此，需要更好地了解其在胰腺癌中的预后价值及其潜在的作用机制。

研究表明，BZW1 的过表达可促进肺腺癌的转移，且与患者的不良预后有关[5]；其次，通过调节TGF-β1/Smad 通路促进前列腺癌细胞增殖[7]；此外，在粘液表皮样癌、卵巢癌、胶质瘤中也可促进恶性增殖[8，14-16]。同样地，BZW2 通过PI3K/AKT/mTOR 途径促进肝细胞癌和骨肉瘤的进展[9，10]，还可以激活ERK/MAPK 途径来驱动结肠癌的进展[17]。本研究结果表明，高表达BZW2 的胰腺癌患者可能更容易发生远端转移和进展到疾病晚期。因此，这些数据共同表明BZW2 在驱动肿瘤的进展方面具有独特的作用。除此之外，BZW2 可调控膀胱癌细胞的生长[18]，并且与肺腺癌患者预后不良有关[6]。上述多项研究指出BZW1 和BZW2 的表达极大促进肿瘤细胞的增殖。本研究基于GO 和KEGG 分析推测其原因可能是在转录后水平上进行调控，通过形成翻译起始复合物，加快肿瘤细胞生长必需物的合成，从而导致肿瘤细胞的恶性增殖。此外，高表达BZW2 与肿瘤微环境中免疫浸润细胞的大量减少有关，表明高表达BZW2 有利于肿瘤逃避机体的免疫监视，从而促进胰腺癌的进展。

本研究主要利用TCGA 和GTEx 数据库确定了BZW1 和BZW2 可作为胰腺癌患者潜在的预后标志物，该方法基于大样本大数据，避免样本量不足，弱化了个体差异，与少量胰腺癌患者样本进行分析相比更加准确和高效。另外，采用总生存期、疾病特异生存期、无进展间期这三个指标来衡量BZW1 和BZW2 对胰腺癌患者预后的影响，能够极大限度的保证预后准确性。然而，本研究存在一定的局限性：首先，患者的临床信息主要来源是TCGA 数据库，绝大部分是白人或非洲人。因此，将此次研究的结果外推到其它种族时需谨慎。虽然此次为回顾性研究，但也为BZW1 和BZW2 在胰腺癌中的功能研究提供了线索，并为胰腺癌的治疗提供了靶点。