线粒体DNA与心肌梗死后的炎症反应

孙伟，王倩怡，张璐莎，冷雨泽，李梦瑶，薛岳进，陈璐，王虹

近年来，线粒体DNA（mtDNA）作为一种免疫调节物质引起了人们的广泛关注。在正常生理状态下，线粒体DNA被包裹在线粒体的双层膜结构中。但在病理条件下，它会被释放到细胞质从而激活先天免疫信号通路，包括toll样受体、炎性小体和环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路，这些信号通路参与触发下游信号和刺激产生效应分子。炎症免疫在心肌梗死后心肌的损伤与修复过程中发挥重要作用。本文将对心肌梗死后线粒体DNA引起炎症免疫反应的机制和线粒体DNA内化的机制进行探讨。

1 引言

1.1 线粒体与线粒体DNA的结构与功能线粒体的起源可追溯到大约15亿年前，它被认为是真核细胞祖先中一种α原生细菌的一种内共生[1]。线粒体逐渐进化成对细胞内稳态有着至关重要的生物学作用的细胞器，参与调节细胞钙代谢和信号传递，控制产热，产生大多数细胞活性氧，是细胞程序性死亡的守门人[2,3]。线粒体还具有重要的生物合成活性，参与生物大分子代谢。这个细菌起源的细胞器不仅被免疫系统所耐受，而且是细胞防御的中心调节器。但是，线粒体内仍隐藏着一种先天免疫激动剂：它自身的基因组—线粒体DNA（mtDNA）。通常线粒体DNA的结构被简单描述为质粒式结构，但超分辨率成像显示，它是由一个复制的mtDNA的和一些不同的蛋白质紧密结合组成的致密类核[4]，结构与细菌祖先高度相似，包含大量未甲基化的DNA，如CpG岛[5-7]。线粒体基因组编码37个基因，除了2个核糖体RNA成分和22个tRNAs外，还有13个mRNA参与了呼吸链关键成分的编码[8,9]。在线粒体中估计有1000多种蛋白质，除mtDNA自己编码的蛋白质外，其余蛋白质都是在细胞质中被翻译然后入线粒体[10]。

1.2 线粒体DNA与炎症反应线粒体DNA通过诱导免疫信号通路或引起病理状态，参与多种类型的先天免疫反应。有研究指出，在特定情况下线粒体释放的mtDNA激活不同的先天免疫通路，可能包括toll样受体、环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路和炎性小体。线粒体通常是以连接网的形式存在，可在心肌和骨骼肌周围被发现。线粒体网络上碎裂的小球体发生有丝分裂，可能是线粒体DNA暴露到胞浆中的一种原因[11]。

2 心肌梗死后的炎症反应

2.1 心肌梗死急性心肌梗死（AMI）以及随之而来的心力衰竭是导致人们死亡和残疾的主要原因之一。AMI后，减少急性心肌缺血/再灌注损伤（IRI）、保护心肌和限制心肌梗死面积最有效治疗方法是及时使用直接经皮冠状动脉介入治疗（PPCI）进行心肌再灌注。然而，心肌再灌注过程本身会造成心肌细胞死亡和心肌损伤，即“心肌再灌注损伤”，可占心肌梗死面积的50%[12]。因此，在AMI发生后需要减小心肌梗死面积，同时防止不利的左心室重构，减少心力衰竭的发作并改善临床结果[13]。急性缺血再灌注损伤后的炎症反应在确定心肌梗死面积和不良心室重构方面起着关键作用。

2.2 炎症免疫应答参与心肌梗死后心肌的损伤与修复研究认为，心肌梗死后心脏的修复过程可分为3个阶段：炎症期、纤维增殖期及稳定期[14]。在炎症期，急性心肌缺血的发作会诱发最初的炎性反应，其目的是清除心肌梗死区的坏死细胞碎片。PPCI后继发的心肌再灌注损伤，加重了这种促炎反应[15]。纤维增殖期及稳定期是抗炎的修复阶段，这一阶段通过伤口愈合和瘢痕形成防止心脏破裂。炎症反应和抗炎修复期之间的过渡是由心脏内部的多种细胞组织（包括心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和间质）和免疫反应的组成部分（包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞）共同完成的。两个阶段的平衡和过渡受到干扰会加剧IRI，并导致心肌梗死后左室的不良重构。

2.3 心肌梗死后炎症免疫应答的启动心肌梗死后，在心肌梗死区坏死的细胞和基质碎片产生的损伤相关模式分子（DAMPs），通过与模式识别受体（PRR）结合，激活固有免疫系统，产生强烈而短暂的炎症反应[16]。当DAMPs与PRRs结合后，启动下游促炎信号通路，促使炎症细胞向梗死心肌浸润，并清除这些坏死细胞及细胞外基质碎片。心肌梗死后活性氧（ROS）的产生也能通过激活 NF-κB 信号通路启动细胞因子和趋化因子的合成，从而促进炎症细胞趋化聚集[17]。

线粒体约占人类心脏的30%，线粒体DNA作为一种DAMP，能触发免疫应答并引起有害的无菌性炎症[18]。mtDNA可刺激许多PRR，包括TLR9、cGAS以及炎性小体等。Toll样受体（TLRs）是一类常见的PRR。目前为止在哺乳动物中发现有13种TLRs，其中TLR2和TLR4是启动心肌梗死后炎症反应的重要调节因子[19,20]。研究发现，以TLRs为治疗靶点可促进心肌梗死后心脏修复并有效减小心肌梗死面积[21]。

3 心肌梗死后线粒体DNA引起的炎症反应

3.1 线粒体DNA作为免疫系统的刺激物因为线粒体可能源于细菌，被认为是“外来物”，mtDNA在细胞中会被视为不同于“自身”的DNA。线粒体DNA的异常甲基化情况为这种理论提供了依据。研究发现，尽管线粒体中存在DNA甲基转移酶[22,23]，但mtDNA与核DNA（nDNA）相比是低甲基化的[24,25]。mtDNA的异常甲基化模式，包括CpG基序上的5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）[26]，也有研究发现mtDNA中没有CpG甲基化[27]。mtDNA拥有的类似于细菌DNA的未甲基化的CpG基序，可能是mtDNA与一些PRR结合的潜在原因。

还有研究认为，电子传输链是活性氧的主要来源，存在于线粒体基质中的mtDNA与电子传输链非常接近。因此，它特别容易被氧化，导致mtDNA突变，可能是导致糖尿病[28]、癌症[29]和衰老的发病机制。将mtDNA注射到小鼠的关节中会导致局部炎症和关节炎[30]，进一步研究发现炎症依赖于线粒体DNA中存在的氧化损伤碱基（ODN）。此外，线粒体转录因子A（mtTFA，简写为TFAM）本身可能也具有免疫刺激作用[31]。

3.2 线粒体DNA与TLR9Toll样受体是PRRs中最为常见的一类[32]。TLR1、TLR 2、TLR 5和TLR 6在细胞表面表达，TLR3、TLR 7、TLR 8和TLR 9在细胞内的溶酶体中发现，其中TLR3、TLR 7和TLR 8识别RNA而TLR9识别DNA。TLR9会在心肌细胞中表达。

一项研究发现，通过TLR9抑制mtDNA的降解，可以诱导心力衰竭小鼠产生炎症和心功能障碍，线粒体DNA还会导致心肌细胞死亡和线粒体功能受损。靶向破坏mtDNA可保护大鼠心脏免受体内缺血-再灌注损伤[33]。在另一项研究中，TLR9基因缺失小鼠用阳离子纳米载体和mtDNA引起肺坏死，小鼠存活率得到了改善[34]。进一步研究发现在骨髓分化因子88（MYD88）和TLR9缺失的肺坏死小鼠模型中，mtDNA造成的肺炎损伤明显减少，表明潜在机制可能是TLR9-MYD88信号传导通路。还有研究者给正常小鼠静脉注射含有大量mtDNA的线粒体碎片，刺激小鼠全身产生了炎症反应，而在缺失TLR9型小鼠中这种反应显著降低[35]。此外，TLR9的表达水平似乎与胞质mtDNA的水平有关，mtDNA释放水平的增加诱导了TLR9的高表达[36]。

因为线粒体DNA与细菌DNA相似，可能含有高含量的未甲基化CpG，可诱导心肌炎症，并可能通过激活TLR9而降低心肌细胞收缩力[37]。TLR9主要通过MYD88依赖通路产生信号，最终激活NF-κB并转录其下游基因。含有不同程度的未甲基化CpG可作为mtDNA与TLR9受体结合的配体：NF-κB通路（CpG B）或干扰素调节因子通路（CpG A），或同时激活两种通路（CpG C）[38]。总之，心肌梗死后mtDNA与TLR9的相互作用不仅激活了先天免疫系统，而且增强了随后的炎症反应。

3.3 线粒体DNA作为干扰素信号的刺激物研究发现，在缺氧复氧条件下mtDNA是通过NF-κB和干扰素信号调节因子途径引起心肌梗死后的炎症反应[39]，线粒体DNA也是干扰素信号的刺激物。

干扰素基因刺激因子（STING）是一种位于内质网中的细胞质DNA感受器蛋白。已有研究表明，由微生物病原体DNA引起的免疫反应与STING途径有关，STING蛋白在激活之后，诱导干扰素调节因子3（IRF3）转移到细胞核，刺激I型干扰素基因的转录，并激活NF-κB信号通路[40,41]。与微生物DNA相似的线粒体DNA是否通过STING途径介导先天免疫引起关注[42,43]。

研究表明，线粒体DNA是激活STING途径调节干扰素（IFN）响应的关键因素[44]。凋亡酶（caspases）的缺失是I型IFN基因转录增强的原因。这种生物学现象与Bak-Bax有关，Bak-Bax是属于BCL2家族的促凋亡蛋白，与线粒体外膜的通透性有关，能促进膜间隙相关蛋白的释放。此外，它们还参与了mtDNA的释放和细胞色素C的释放，从而激活了固有凋亡途径。一般认为，细胞凋亡不会刺激炎症反应。然而，当凋亡酶被抑制时，mtDNA将继续诱导cGAS-STING调节途径的I型IFN信号[45-47]。

3.4 线粒体DNA作为炎性小体激活剂炎性小体是先天免疫系统的胞质多蛋白聚体，参与炎症反应的激活。目前的研究中，已有六种不同类型的炎性小体被报道：NLRP1、NLRP3、NLRP6、，NLRP12、AIM-2以及NLRC4-IPAF[48]。mtDNA与炎性小体直接结合，激活下游caspase-1和下游因子（如IL-18和IL-1β）成熟。

2011年首次报道了mtDNA作为炎性小体激活剂[48]。该研究发现，自噬蛋白的抑制提高了巨噬细胞内胞质mtDNA对脂多糖（LPS）或ATP的响应水平。该研究还发现mtDNA的释放受到线粒体活性氧的介导，也与NLRP3的浓度有关，释放的mtDNA对LPS和ATP应答从而使IL-18和IL-1β产生。此外，NLRP3除了作用于mtDNA释放的下游，还作用于上游，以促进线粒体上MPTP的形成，从而允许mtDNA释放。但MPTP是否能够让线粒体中的mtDNA释放到细胞质中仍存有疑问。

类似的研究证实，在巨噬细胞凋亡过程中，mtDNA被释放并与NLRP3结合[49]。且NLRP3更倾向于氧化的mtDNA，表明活性氧在炎症小体激活中起着关键作用[50]。线粒体DNA被ROS氧化并释放到细胞质中，然后它激活NLRP3并刺激IL-1β的分泌[51]。但是，许多不同信号都被认为是NLRP3激活的共同信号，故NLRP3作为mtDNA的直接靶标仍存有争议[52]。

3.5 线粒体DNA内化的机制mtDNA位于线粒体的双膜结构中，要与TLR9相互作用，须从线粒体中并释放到细胞质中，或者当mtDNA在细胞外时，通过某种机制而内化[53]。因为mtDNA带高负电荷，很难通过细胞膜上的带电孔隙，跨膜扩散不是其内化的方式。目前，细胞外线粒体的内化机制尚不明确，吞噬、内吞、受体介导的内吞和跨膜扩散被认为是线粒体内化的可能机制[54,55]。吞噬作用有一些证据支持，巨噬细胞可携带因细胞坏死而释放出的完整线粒体[56]。一些研究发现，mtDNA与其他辅助因子（如高迁移率类蛋白1和晚期糖基化终产物受体）的相互作用，促进了免疫细胞的内化过程[57,58]。也有研究发现，mtDNA与B细胞受体结合后刺激自身反应性B细胞，导致mtDNA内化结合TLR9[59]。此外，细胞外的mtDNA是通过TLR9被心肌细胞内化并激活NF-κB[60]。

近年来，研究者将目光投向了核仁素（NCL，C23），核仁素是真核细胞核仁中含量丰富的一种多功能蛋白[61]。它在翻译后被修饰和调控，包含四个DNA结合位点和众多的糖基化和磷酸化位点[62]。核仁素涉及核糖体成熟、RNA和DNA代谢，以及不均一核RNA（pre-RNA）从细胞核到细胞质的转运[63]。一些研究发现，细胞表面的核蛋白与T淋巴细胞中人类免疫缺陷病毒的内化[64]、DNA纳米颗粒的摄取有关[65]。最新研究发现，核仁素在心肌细胞的细胞膜上高度表达。抑制核仁素可减少IL-1β、TNFα和IL-6在心肌细胞的表达，而mtDNA和心肌细胞膜上的核仁素结合，表明核仁素可能促进免疫原性DNA在心肌细胞中的摄取[18]。

3.6 线粒体DNA在细胞间转移除mtDNA的细胞内生物学效应外，释放的线粒体DNA可能会从一个细胞移动到另一个细胞，从而将炎症信号“传递”到另一类细胞中。现在已经确定线粒体，包括线粒体DNA，是可以在细胞间转移的。细胞间线粒体的转移可能是一种进化保护的现象，与线粒体作用受损有关[66]。有研究报道，在大脑、心脏和肺上皮的缺血刺激性损伤后，细胞间线粒体转移的现象[67]。细胞融合、微囊和隧道膜纳米管似乎是细胞间线粒体转移的可能机制[68]。mtDNA的细胞间转移及这一现象在心肌梗死后的炎症免疫反应中的作用值得人们的关注。

4 总结和展望

线粒体是具有多种功能的细胞器，协调着细胞的生存和死亡，是细胞能量的来源地，是细胞防御的调节器，而且ATP、甲酰肽和线粒体DNA等会触发先天免疫反应。近年来，研究者们对线粒体及线粒体DNA在炎症和免疫中的作用有着浓厚的兴趣，关于线粒体DNA引起炎症反应与内化、转移等方面做了大量工作。

触发先天免疫系统的内源性分子被称为损伤相关分子模式（DAMPs）。缺血后心肌细胞释放的DAMPs包括线粒体DNA。刺激先天免疫系统的受体，包括炎性小体（如NLRs）和类toll样受体（TLRs）。目前研究表明，mtDNA拥有类似于细菌DNA的未甲基化的CpG基序，是线粒体DNA成为免疫系统刺激物的原因。心肌梗死后从线粒体中释放的mtDNA激活不同的先天免疫通路，包括toll样受体、干扰素信号调节因子通路和炎性小体。Toll样受体是主要的通路，梗死后心肌细胞的缺氧再复氧与mtDNA一起协同识别TLR-9受体，诱导NF-κB响应，从而引起炎症免疫反应。此外，干扰素信号因子通路和炎性小体也发挥了作用。

关于线粒体DNA如何从线粒体转移到细胞质中以及线粒体可能在细胞间的转移，其机制尚不明确。研究认为，吞噬、内吞、受体介导的内吞均是线粒体内化的可能机制，包括巨噬细胞携带因细胞坏死而释放出的完整线粒体，线粒体DNA与其他辅助因子的相互作用以及核仁素促进免疫原性DNA在心肌细胞中的摄取等。线粒体DNA的内化机制的研究将有助于对mtDNA引起炎症反应的治疗。线粒体DNA在细胞间的转移，不同于以往局限于细胞内的生物效应，而是一个内环境的整体视角，正因它的复杂性，也吸引了众多研究者的关注，为今后研究心肌梗死后先天免疫系统的反应提供更多的思路和启迪。