铜死亡与肿瘤的关系研究进展

黄本林，付 瑞，王 宁，李晓东，孙继芹，朱星成，段 勇

作为参与能量转换、铁收集、氧运输和细胞内氧化代谢必需酶的催化辅助因子，细胞中适量的铜对生命活动是不可替代的[1]。然而，通过稳态机制可以确保细胞内的铜浓度维持在低水平，以防止细胞内有害游离铜的积累[2]。另一方面，铜固有的氧化还原特性使其对细胞既有益又有潜在毒性。Cu2+和Cu+是铜的两种氧化态，其中Cu+被认为是细胞质还原环境中的主要形式。其他必需金属，如铁的毒性机制已经明确，但铜诱导的细胞毒性机制仍旧是个谜团。 最近TSVETKOV等[3]揭示了一种新的细胞死亡形式，铜依赖的细胞死亡(简称为铜死亡)，为一种非凋亡细胞死亡途径。他们已经证明，铜可以直接与三羧酸循环(TCA)中的脂酰化成分结合，这些铜结合脂质化线粒体蛋白的聚集及随之出现Fe-S簇蛋白的丢失,引发了蛋白质毒性应激和一种独特形式的细胞死亡。遗憾的是，国内暂无铜相关细胞毒性的基础研究和临床试验。为此，我们对铜死亡相关疾病生物学标志物和治疗方法及药物面临的机遇与挑战进行如下综述。

1 铜与肿瘤

1.1铜增生 GE等[4]首次提出铜增生的概念，即依赖铜的生长或增殖，描述了铜通过信号通路的主要和次要效应，包括酶促和非酶促铜调节活动。铜增生将成为药理学目标，铜信号可以被铜选择性螯合剂抑制，或者可以被金属离子载体激活，从而提高铜水平或在空间和时间上重新分配到细胞和亚细胞池中。与铁死亡相似，铜还可以通过线粒体依赖性能量代谢增加和活性氧积累引起的细胞毒性介导细胞死亡，这一过程被称为“铜死亡”[5]。所以，铜死亡的首次提出存在一定争议，但确实是TSVETKOV等[3]首次阐明铜死亡的作用机制。

1.2铜稳态 和其他金属一样，细胞内铜分布池分为2个部分：紧密结合的蛋白质池(微摩尔级别)和生物可利用的不稳定池(飞摩尔水平)[6-7]。铜蓝蛋白是哺乳动物血浆中可交换性铜的主要蛋白载体[7]，其他如细胞质金属伴侣(ATOX1)及细胞质-线粒体金属伴侣蛋白等兼具铜转出和金属伴侣的功能[8-9]，共同维持适当的细胞内铜生物利用度，并确保铜依赖酶的金属化，包括细胞色素c氧化酶、超氧化物歧化酶等[7]。

1.3肿瘤中的铜状态 Wilson病患者肝癌发生风险上升，提示异常的铜积累可能通过一种未知的机制促进细胞恶性转化[10]。从某种程度而言，与非分裂细胞相比，癌细胞对铜的需求更高[11-12]。据报道，已经在动物模型和多种肿瘤患者肿瘤组织或血清中观察到铜浓度的升高[11]。铜失衡会影响线粒体呼吸、导致糖酵解、胰岛素抵抗和脂质代谢的变化[13-15]，也可通过ATOX-ATP7A-LOX途径促进转移性扩张[9]，通过ULK1和ULK2调节自噬[16]，激活血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、肿瘤坏死因子和白细胞介素-1，从而促进血管新生导致肿瘤细胞的生长和转移。

1.4铜靶向治疗策略 对于铜稳态相关遗传性疾病，铜离子载体和铜螯合剂均被认为是临床常用的有效治疗药物[17-21]。然而在肿瘤方面，对铜毒性的研究却没有那么成功[22]。虽然依尔氯莫尔(铜离子载体)已经开展了相关临床试验，但是这种试验既没有探索到生物学标志物，也未对药物作用机制进行深入了解[23]。因此，未来应该考虑使用生物学标志物进行铜离子载体的临床试验，这将对铜靶向治疗策略的开发具有重要意义。

2 铜死亡与肿瘤

2.1铜死亡 既往结构-功能关系实验表明，修饰铜结合小分子化合物的能力将导致细胞杀伤力减弱，铜螯合剂消除了该化合物的细胞毒性[24]。为了进一步确定铜离子载体的细胞毒性是否依赖于铜本身，分析伊利司莫(ES，一种强效铜离子载体)的杀伤潜力就显得非常关键。首先，有学者研究铜离子载体的毒性是否依赖于已知细胞死亡模式的诱导，实验显示，通过药物或基因敲除的方法抑制细胞凋亡，并不能抑制多个肿瘤细胞系中ES-Cu复合物诱导的细胞死亡。还发现，亲水抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)通过螯合细胞内铜来阻断ES-Cu的毒性，N-乙酰半胱氨酸、α-生育酚、依布硒等抗氧化剂并不能逆转ES-Cu的生长抑制作用，这表明活性氧不是铜死亡必需的[3]。后续一系列结果表明，铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累。最终，提出了“铜死亡”的全新概念，即不断积累的铜与TCA中的脂酰化成分直接结合，引起脂酰化蛋白聚集和随后的Fe-S簇蛋白丢失，导致蛋白质毒性应激和最终的细胞死亡。这是一种新的非凋亡细胞死亡途径，不同于其他已知的调控细胞死亡机制，包括凋亡、焦亡、坏死和铁死亡。

ES在细胞外结合Cu2+，并将其运输到细胞浆，铜离子积累主要通过FDX1介导的线粒体蛋白毒性应激引起铜死亡。一方面，FDX1将Cu2+还原为Cu+，促进参与线粒体TCA调控的脂酰化和酶(特别是DLAT)的聚集。另一方面，FDX1引起Fe-S簇蛋白的不稳定，除了铜离子载体外，铜转入通道(如SLC31A10)和转出通道(如ATP7B)通过影响细胞内Cu+水平来调节铜化敏感性。GSH作为一种含硫醇的铜螯合剂，可以阻断铜死亡的发生，而丁硫胺酸亚砜胺则通过耗尽GSH来诱导铜死亡。线粒体丙酮酸载体抑制剂UK5099和电子传递链复合物Ⅰ/Ⅲ抑制剂(如鱼藤酮和抗霉素A)可减弱ES诱导的铜死亡。

2.2铜死亡相关基因(CRGs)预测肾透明细胞癌(ccRCC)临床预后 虽然铜稳态的失调可能触发细胞毒性，但是细胞内铜水平的改变可能也影响肿瘤的发生和进展。最近有研究表明，与健康者相比，肿瘤患者在血清和肿瘤组织中的铜水平显著升高[13]。基于此，铜离子载体相关药物和铜螯合剂已经应用于抗肿瘤治疗。BIAN等[25]对10个CRGs(CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1和PDHB)在ccRCC中的表达情况展开深入研究。其中，只有CDKN2A在ccRCC中表达上调，其余9个基因表达下调。进一步分析发现CDKN2A、DLAT、FDX1和LIAS与免疫浸润水平显著相关，CDKN2A、FDX1和LIAS与ccRCC患者临床分级、分期及总体生存率和无进展生存期显著相关。

其实，既往研究已经表明FDX1是TCA中蛋白脂质化过程中的上游调控因子和铜死亡关键调节因子[26]，二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶(DLAT)是丙酮酸脱氢酶复合体的组成部分，铜和TCA中的脂酰化蛋白结合后促使DLAT寡聚集，这些均是铜死亡核心机制的关键环节。CDKN2A的表达在细胞周期控制中发挥作用，并与多种肿瘤的起源密切相关[27]。根据一项meta分析发现，在76%的转移性ccRCC样本中显示CDKN2A缺失[28]。更多CRGs的临床标志物还需要在人群样本中进行验证，这将为ccRCC的治疗和预后预测提供新的选择。

2.3铜死亡相关长链非编码RNA(LncRNA)与肝细胞癌(HCC) LncRNA是指长度超过200 nt的RNA，其本身不编码蛋白，而是以RNA的形式多层面调控基因的表达。LncRNA与物种进化、胚胎发育、物质代谢及肿瘤的发生等均有密切的关系。铜离子积累引起的细胞毒性可能调节肿瘤细胞的生长和增殖速率，而这与LncRNA的联系又如何？ZHANG等[29]在HCC患者肿瘤组织和正常组织中发现了107个与铜死亡相关的差异表达的LncRNA(DE-lncRNAs)，其中16个候选DE-lncRNAs与HCC患者预后高度相关，最终纳入6个DE-lncRNAs建立多因素Cox回归模型：风险评分=AC138904.1×0.07981-AC099329.2×0.17935+DEPDC1-AS1×0.15452+GIHCG×0.15857+AC145343.1×0.22327-DNMBP-AS1×0.17083，其中AC099329.2、DNMBP-AS1为保护性LncRNA，AC138904.1、DEPDC1-AS1、GIHCG、AC145343.1为风险性LncRNA。AC099329.2和DNMBP-AS1与铁死亡密切相关，可作为预测乳腺癌预后的新型生物学标志物[30]，与此同时，DNMBP-AS1还参与了铁死亡在肺腺癌发生发展中的调控过程[31]。既往研究表明，AC145343.1可作为TP53突变相关的LncRNA参与免疫浸润的调控，并预测HCC患者的预后[32]。进一步对该多因素Cox回归模型进行分析，发现评分较低的患者预后较好，时间依赖性受试者工作特征曲线分析结果显示，该模型对HCC患者1、3、5年生存率预测的曲线下面积分别为0.739、0.725和0.734。采用ES诱导铜死亡细胞模型，HerpG2细胞株中的AC138904.1、AC099329.2、GIHCG和DNMBP-AS1在药物治疗前后发生明显变化，而在MHCC-97H细胞株中，只有AC138904.1、AC099329.2、DNMBP-AS1前后发生明显变化，这3个LncRNA与离子转运调控密切相关。另一方面，还发现风险评分较高人群B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、CD4+T1细胞、CD4+T2细胞浸润和PD1、CTLA4表达明显高于低风险评分人群，提示此类患者更适合免疫抑制治疗。

2.4CRGs预测黑色素瘤免疫浸润和疾病进展 皮肤黑色素瘤(SKCM)由黑色素细胞的恶性转化引起，是最具侵袭性和最致命的皮肤癌类型，虽然仅占所有皮肤癌的1%，但是约占皮肤癌死亡人数的80%[33]。铜死亡作为一种新发现的调节细胞死亡形式，在肿瘤的发生、发展和预后中的作用尚不清楚，其在SKCM免疫、靶向治疗方面的潜力非常值得挖掘。LV等[34]研究发现，与正常组织相比，在黑色素瘤中有11个表皮生长相关突变基因(FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1、MTF1、GLS、CDKN2A、SLC31A1和ATP7B)表达上调，且发现高表达组总生存期更长。其中，LIPT1基因可作为黑色素瘤预后良好的一个指标，上调LIPT1可能通过破坏线粒体中的TCA，进而诱导细胞萎缩，从而抑制肿瘤的发生和发展，LIPT1表达与PDL1表达呈正相关，与调节性T细胞浸润呈负相关。

2.5铜死亡模型在胶质瘤肿瘤-免疫相互作用中的预测作用 CHEN等[35]利用转录组数据发现，铜活动评分(CuAS)与肿瘤免疫浸润有关，确定了5个信号通路和8个配体-受体对，包括ICAM1、ITGAX、ITGB2、ANXA1-FRR1等，阐明铜死亡与肿瘤细胞和免疫细胞之间的紧密联系，并且预测了13种针对高CuAs胶质瘤的潜在药物，如寡霉素A、双氢青蒿素等。该铜死亡预测模型在胶质瘤肿瘤-免疫相互作用和个性化治疗方面具有一定参考价值。

2.6CRGs在三阴性乳腺癌(TNBC)中的研究 TNBC占浸润性乳腺癌的15%～20%，具有高异质性、侵袭性和复发风险[36]。缺乏特异性靶向治疗药物，是抗TNBC治疗失败和患者最终死亡的关键原因。铜死亡与肿瘤进展、预后和免疫反应有关，在TNBC中如何？乳腺癌中CRGs的表达变化具有高度异质性，揭示了CRGs表达失衡在乳腺癌发生发展中起关键作用。有研究显示，采用多因素Cox回归分析筛选出5个CRGs，其中ATP7A、DLST和LIAS高表达水平与较短的总生存期相关，而LIPT1和PDHA1高表达水平表明预后良好[37]。该5个CRGs主要参与生物过程和分子功能，较少参与细胞成分。KEGG代谢通路分析显示：5个CRGs在TCA中显著富集，可能通过负调控线粒体代谢功能影响疾病的发生。并发现了以CTLA-4/PD-1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂治疗反应。CRG评分组患者仅在抗CTLA-4治疗时显示出显著的治疗效果，这可能部分解释当前TNBC免疫靶点与免疫治疗效果之间的不匹配。ATP7A表达下调显著抑制了乳腺癌细胞的增殖和迁移能力，这与其对乳腺癌患者的促肿瘤作用一致。CRG评分是评估TNBC预后可靠且独立的方法，还与药物敏感性有关，为提高患者免疫治疗的效果、识别不同的TNBC免疫表型、促进未来精准个性化的免疫治疗提供了新的思路和方向。

2.7其他肿瘤 基于8个与突变相关的LncRNA预后标志物(AL132800.1、AC090587.1、AC079160.1、AC011462.4、AL157888.1、GRHL3-AS1、SNHG16、AC021148.2)构建的多因素Cox回归分析模型，在预测头颈部鳞癌对免疫治疗药物敏感性方面具有较好的应用前景[38]。HAN等[39]也发现ADAMTS9-AS1、CASC2、LINC00680、SNHG1、TRG-AS1等LncRNA是软组织肉瘤的独立预后指标，并且可能在肿瘤免疫微环境中发挥作用，可为软组织肉瘤患者治疗提供新的治疗靶点。也有研究发现了10个CRGs的LncRNA特征，为结肠腺癌患者预后和药物选择提供了新方向[40]。

3 挑战

铜死亡机制的探索无疑为人类疾病治疗带来了很多憧憬，但还迫切需要探索过度积累导致细胞损伤的现象是否是所有金属的共同特征[23]，特别是对于一些通常用作药物载体的金属(如金和硅)。此外，铜在肿瘤中的毒性分子机制及铜死亡演变为确定的细胞死亡的具体模式是否需要进一步阐明？另一方面，考虑到肿瘤中脂酰化蛋白的丰度和呼吸模式的差异，需要在各种疾病模型甚至细胞类型中确定导致细胞毒性的精确浓度范围，然后建立合理的个性化治疗策略。铜诱导细胞毒性的临床试验要么基于从适当的患者群体中发现生物学标志物，要么基于分子作用机制的深入理解。研究中观察到，在很多肿瘤中，FDX1的丰度与脂酰化蛋白高度相关，而含高水平脂酰化蛋白的细胞系对铜死亡非常敏感，表明铜离子载体治疗应针对具有这种代谢特征的肿瘤[3]。

4 总结与展望

铜死亡的发现开启了一条新的细胞死亡途径，通过充分利用铜的病理生理作用，为人类疾病防治提供了新思路和可能。冷泉港班伯里中心实验室已经建立了铜癌联盟，该领域的快速发展在不同学科间建立了新的联系。经过一系列安全性和有效性测试，可以帮助将铜的化学和生物学基础研究转化为潜在的临床疗法和潜在的候选药物，利用铜依赖疾病的易感性，不仅在人类遗传性疾病方面，还是在肿瘤方面的应用前景将会更加不可估量。