农药残留对普洱茶发酵中挥发性香气物质的影响

单治国，黄红平，满红平，颜学行，赵 媛，周红杰，张乃明，张春花*

（1.普洱学院 农林学院，云南 普洱 665000；2.云南农业大学 茶学院，云南 昆明 650201；3.国家普洱茶产品质量监督检验中心，云南 普洱 665000）

随着农业的发展和人们对食品安全问题的日益重视[1]，普洱茶中农药残留问题越来越受到消费者的高度关注，也成为我国普洱茶安全涉及的首要问题之一。茶树在生长过程中，直接喷洒农药，在采摘、萎凋、杀青、干燥、发酵、蒸压、存贮、运输等过程中环境污染也可能会导致茶叶中残留农药，甚至可能超标[2]。目前，茶叶中的农药残留是影响我国茶叶出口的主要技术性贸易壁垒[3]。普洱茶以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征。普洱茶分为普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）两大类[4]。在普洱茶原料的栽培区域，由于夏秋季节多雨、高湿、高温，常导致真菌病害的频繁发生。因此，使用农药预防和防治病害的侵染、爆发成了茶区普遍采用的方法。由于茶园田间管理不规范，一些杀菌剂、杀虫剂和除草剂等农药存在过量施用的情况，导致部分茶叶产品中农药残留量超标，给中国茶叶的质量安全带来了巨大隐患，这一问题已经引起行业内广泛重视[5]。开展了关于茶叶生产中的农残问题的一系列研究，主要集中在栽培管理[6-8]、加工过程[9-11]、贮藏[12]等方面。

茶叶种植过程中，联苯菊酯（bifenthrin）因其杀虫谱广、高效、低毒、药效持久[13]、茶汤中浸出率低[14-16]、安全间隔期短等特点作为茶园常用的农药之一。国家标准GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定联苯菊酯的最大残留量为5 mg/kg[17]，是允许有残留的农药之一[18]。如果联苯菊酯被摄入体内，会有积累作用，是人体健康存在的风险之一[5]，因此，在保障普洱茶产量、品质的同时，在生产环节尽可能减少联苯菊酯的使用量显得尤为重要[19]。香气和内含成分是评价普洱茶品质的重要指标，联苯菊酯的使用会影响普洱茶的品质，决定着普洱茶的风味和典型性，直接影响消费者对普洱茶的感官评价和喜好。普洱茶中香气物质的含量和种类对普洱茶的品质有重要影响，研究接种有益菌进行发酵对普洱茶香气的影响，对于提高和改善普洱茶的质量有重要价值。近年来，国内外在茶叶中农药残留分析检测方面做了大量工作，已经能准确分析近500多种农药残留（杀菌剂、杀虫剂和除草剂等）[20-25]。华建坤等[26]研究发现，普洱生茶农药残留量一般高于经过发酵处理后普洱熟茶中的农药残留量，这主要与普洱茶发酵过程中的微生物分解、高温高湿水解等作用有关。研究表明，残留的农药和酿酒酵母菌会相互作用，农药残留物质会影响酿酒酵母菌等微生物的正常生长代谢[27-30]，抑制酿酒酵母的生长或延迟酿酒酵母的发酵[31]等，同时不利于含氮化合物和硫化物的转化，影响其芳香物质的产生，甚至产生一些不良代谢产物和异味物质[32]；相应酿酒酵母菌能降解或吸附部分农药残留物[33]，虽然在发酵过程中，可以使部分农药降解或转化，但是也会有部分农药和副产物残留在茶叶中，从而影响其品质。

本研究以云南省普洱市主要大叶种晒青毛茶为原料，基于同时蒸馏萃取（simultaneousdistillationextraction，SDE）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，通过将人为喷洒联苯菊酯后的晒青毛茶分别人工接种酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）及对照组（不接菌）进行固态发酵，将4种固态发酵过程中普洱茶挥发性香气物质的变化进行比较分析，以期为普洱茶固态发酵工艺优化及其农药残留安全性标准的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料和菌株

晒青毛茶：选自普洱市茶树良种场种植的云南大叶种茶树（Camellia sinensis（Linn.）var.assamica）上采摘的生态有机一芽三叶、四叶鲜叶加工而成的。

黑曲霉（Aspergillus niger）ZL200510010941.4、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZL 200510010940.X和产黄青霉（Penicillium chrysogenum）：云南农业大学自然科学基金项目研究组从普洱茶固态发酵过程中所分离、纯化、鉴定、保存、筛选、扩繁而得的优势益生菌。

1.1.2 化学试剂

联苯菊酯标准品（纯度为99.7%）：中国计量科学院化学所；2.5%联苯菊酯乳油：苏州富美实植物保护剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-14B型气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）：日本岛津公司；HB-TSZL型同时蒸馏萃取（SDE）装置：安徽长城玻璃仪器制造厂；HWS-24型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验设计

2.5%联苯菊酯经180倍稀释处理后，取50 mL，加水9 L（用药量按实际每重复喷施质量折算，按照晒青毛茶固态发酵潮水量为30%，即每30 kg晒青毛茶叶用水量9 L兑水均勾喷雾），用背负式手动喷雾器在准备用于固态发酵的晒青毛茶（30 kg）上，使其含有一定浓度的农药，让其自然堆放2 h后取样，放置于室内自然晾干至茶样含水量为10%，-30 ℃保存，用以测定香气物质。

试验设置4个处理方式：喷洒药2 h并取样后，分别接种酿酒酵母菌、黑曲霉、产黄青霉和不接菌种处理分别进行发酵。用小型喷雾器将三种有益菌种（酿酒酵母菌、黑曲霉、产黄青霉），按液茶比为1∶10（mL∶g）的比例均匀洒在晒青毛茶上进行普洱茶固态发酵（堆高60 cm，并压实，在表面及四周盖上湿布），每个处理设置3个重复，每个重复30 kg茶叶，人工控制发酵茶堆温度40～60 ℃，相对湿度35%，发酵环境温度25 ℃，环境相对湿度为90%，翻堆6次，分别于发酵后的7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翻堆，并按五点取样法分别采集固态发酵的五个点（固态发酵中心点和距离中心点1 m处的4个点），合并为一个混合待测样品，设3个重复，各1 kg，于室内自然晾干至含水量为10%，以测定芳香物质的量。

1.3.2 分析方法

（1）茶叶挥发性物质的提取

本试验采用SDE法提取茶叶中挥发性香气物质，将采集的发酵后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翻堆样准确称量100 g，装入1 000 mL的蒸馏瓶中，加入500 mL煮沸的蒸馏水，摇匀后加入30 mL二氯甲烷提取3 h，常压蒸馏至不再有挥发性物质馏出为止。将供试茶样置于蒸馏萃取设备内，萃取液经分流除水浓缩至0.5 mL，用气质联用仪进行检测。

（2）挥发性成分的GC-MS分析条件

气相色谱条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气为氦气（He）；进样口温度260 ℃；柱流速1.2 mL/min，进样量1 μL；分流比20∶1；升温程序：起始温度40 ℃（保持2 min），以2 ℃/min升至180 ℃，再以5 ℃/min升温至210 ℃，保持10 min。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；电子倍增器电压1 894 V；电子能量70 eV；扫描范围20～500 m/z。

（3）挥发性组分的定性和定量

利用美国国家标准与技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2.0-Wiley275质谱库对得到的各色谱峰进行串连检索，依据样品中组分的质谱图与GC-MS化学工作站标准物的标准图谱的匹配度以及样品中组分的保留时间与标准化合物在GC-MS上保留时间的匹配度，再参考相关文献，对组分进行定性；采用面积归一化法（各香气组分的峰面积占总峰面积之比值）确定各挥发性化合物的相对含量。

1.3.3 数据分析

挥发性香气物质中各物质的量用SPSS 24.0统计软件进行分析，每个处理重复3次，每个测定重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 联苯菊酯施药前后晒青毛茶中挥发性物质的比较分析

联苯菊酯药前晒青毛茶中挥发性物质香气成分及相对含量结果见表1。由表1可知，从联苯菊酯药前晒青毛茶中共检测出46种挥发性化合物，所鉴定的成分约占挥发性物质色谱峰总峰面积的178.89%；从联苯菊酯药后2 h晒青毛茶中共检测出46种挥发物，所鉴定的成分约占挥发性物质色谱峰总峰面积的245.34%，药后比药前增加66.45%。

表1 联苯菊酯药前和药后2 h茶叶挥发性成分种类和相对含量的变化Table 1 Changes of types and relative contents of volatile components in the tea before and after bifenthrin treatment 2 h

续表

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在联苯菊酯药后2 h晒青毛茶中分别检测鉴定出14种新产生的独有的挥发性物质（苯乙醇、3,7,11-三甲基-1-十二烷醇、1-乙基十六醇、三十七醇、1-乙基十六醇、异硬脂酸甲酯、N-苄氧羰基-L-精氨酸、十三烷等）；且有14种（1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）、2-氨基-1,3-丙二醇、2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-戊二醇、苯乙酮、水杨酸甲酯、乙酸异丁酯、6-氮杂双环[3.2.1]辛烷、N-乙基琥珀酰亚胺、1,5,5-三甲基-6-亚甲基环已烯、二十烯酸等）挥发性物质未检测出；共有组分有32种（芳樟醇、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ）、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅰ）、α-松油醇、香叶醇、（E）-香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺（4,5）癸烯二酮、D-柠檬烯（苎烯）、1-石竹烯等）。联苯菊酯药后产生的挥发物在种类和数量上都有很大的变化，挥发物的种类变化（药前晒青毛茶中存在的14种香气物质在药后2 h未被检测到，并且产生14种新的香气物质）、含量上升（178.89%上升至244.25%），各组分占所有检测到的物质的比例也发生变化，并且对于同一种化合物二者（药前和药后2 h晒青毛茶）在含量上也存在很大差异，有增有减，各挥发物组分在施用农药后相对含量的变化情况不同，这可能是由于其合成途径的差异造成的。联苯菊酯药前晒青毛茶相对含量最大的是叶绿醇（29.85%）、芳樟醇（15.29%）、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺（4,5）癸烯二酮（13.59%）、α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇（13.11%）、水杨酸甲酯（10.12%）、2,6,10-三甲基十四烷（10.88%），其次是beta-紫罗兰酮（8.88%）、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ）（7.74%）、1-石竹烯（7.54%）、香叶醇（6.25%）、2-氨基-1,3-丙二醇（5.99%）、月桂酸异辛酯（5.06%），相对较高的有顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇（4.96%）、α-松油醇（3.81%）、1,3-二甲基萘（3.76%）、2,7-二甲基萘（3.73%）、D-柠檬烯（苎烯）（1.66%）等。

联苯菊酯药后2 h晒青毛茶相对含量最大的是芳樟醇（25.52%）、叶绿醇（21.31%）、棕榈酸甲酯（12.39%）、α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇（10.62%）、2,7-二甲基萘（10.13%）、α-松油醇（10.06%）、2,6,10-三甲基十四烷（10.88%），其次是β-紫罗兰酮（9.98%）、1,3-二甲基萘（9.71%）、1-甲基萘（9.19%）、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ）（9.30%）、（Z,Z,Z）-亚麻酸甲酯（8.07%）、月桂酸异辛酯（8.55%）、2-甲基萘（7.33%）、1-石竹烯（6.87%）、十三烷（6.18%）、香叶醇（6.25%）、亚油酸甲酯（5.66%），相对较高的有顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇（4.61%）、4-氨基-3-甲基苯酚（4.37%）、4,6-二叔丁基间甲酚（4.09%）、D-柠檬烯（苎烯）（1.81%）、水杨酸甲酯（2.78%）、（E）-香叶基丙酮（2.81%）、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺（4,5）癸烯二酮（1.94%）等。由此可见，药前、药后2 h晒青毛茶挥发性香气物质存在种类和含量上存在明显的差异。

从表1可以看出，不同类别的挥发物相对含量所占比例存在着差异，主要以醇类、酯类、酮类、萜烯类、含氮类、烷烃类挥发物为主。联苯菊酯药后2 h晒青毛茶中醇类、酯类、烷烃类、萘、其他类挥发物含量高于联苯菊酯药前晒青毛茶，而酮类、萜烯类、含氮类挥发物变化不明显。说明在联苯菊酯能影响下醇类、酯类、烷烃类、萘、其他类挥发物含量出现增加现象，而对酮类、萜烯类、含氮类挥发物的影响不明显。分析其原因：主要是农药残留物质不利于含氮化合物和硫化物的转化，甚至产生一些不良代谢产物和异味物质[32]。

2.2 联苯菊酯药后晒青毛茶发酵过程中挥发性香气物质比较分析

通过将人为喷洒联苯菊酯后的晒青毛茶分别人工接种酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）及对照组（不接菌）进行固态发酵，将4种固态发酵过程中普洱茶挥发性香气物质的变化进行比较分析，结果见表2。由表2可知，联苯菊酯施药后至发酵结束，不接菌的普洱茶发酵后期出现7种新物质、接酵母菌发酵后期出现9种新物质、接黑曲霉发酵后期出现13种新物质、接产黄青霉发酵后期出现19种新物质；四种处理普洱茶中主要以醇类、酯类、含氮类、萘类物质为主，其中以叶绿醇（9.77%、12.96%、10.15%、10.95%）、1-石竹烯含量（7.47%、20.09%、8.53%、11.41%）最高。

表2 联苯菊酯药后处理4种固态发酵过程茶叶中24种挥发性成分的变化Fig.2 Changes of 24 volatile components in the tea during four kinds of solid-state fermentation process after bifenthrin treatment

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联苯菊酯施药后接菌和不接菌的发酵过程中，24种主要的挥发性物质（药后2 h和出堆样中检测出）的变化规律存在一定的相似性和差异性。在4种固态发酵情况下，丁香花气味的1-石竹烯含量都呈现增加趋势，不接菌处理的增加量（8.7%）低于接种酿酒酵母（192.4%）、黑曲霉（24.2%）、产黄青霉（66.09%）；具强的木香、花香、萜香、青香气芳樟醇、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅰ）、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ），α-松油醇、三十七醇、叶绿醇、2,7-二甲基萘、1,3-二甲基萘、2,6,10-三甲基十四烷、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、（Z,Z,Z）-亚麻酸甲酯、月桂酸异辛酯含量呈现下降趋势，不接菌处理的下降量（93.75%、59.55%、62.04%、96.62%、76.34%、54.14%、100%、100%、100%、82.31%、73.49%、74.58%、80.19%）高于接种酿酒酵母（87.17%、22.06%、30.01%、91.40%、72.22%、39.13%、91.17%、95.13%、91.81%、74.08%、72.70%、72.91%、65.16%）、黑曲霉（90.28%、34.90%、45.97%、95.40%、66.80%、52.38%、93.41%、92.04%、86.74%、75.58%、70.31%、69.26%、74.89%）、产黄青霉（89.53%、42.10%、59.52%、93.04%、70.54%、48.60%、91.91%、90.06%、87.66%、75.98%、68.56%、68.81%、72.24%）。这与国外关于残留农药对葡萄酒品质的影响结果类似[34-35]。

联苯菊酯药后至发酵结束，在不接菌的普洱茶中顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、2,7-二甲基萘、1,3-二甲基萘、（E）-香叶基丙酮、2,6,10-三甲基十四烷未检出。

联苯菊酯药后至发酵结束，具有令人愉快的气味，类似于薄荷、樟脑味的长叶薄荷酮和三甲基乙酸香芹烯酯只有在接种酿酒酵母（0.30%、1.19%）、黑曲霉（0.27%、0.76%）、产黄青霉（0.28%、0.79%）的普洱茶中检测出；11-十六炔-1-醇、亚麻酸在4种固态发酵情况下都有检测出，其不接菌处理的含量（1.74%、0.95%）低于接种酿酒酵母（2.77%、0.98%）、黑曲霉（3.45%、1.52%）、产黄青霉（2.78%、1.99%）。

目前，微生物对普洱香气的影响主要是导致其产生了大量的甲氧基苯类化合物，刘通讯等[35]认为，甲氧基苯类及其衍生物能够有效改善茶叶的粗老味，使普洱茶香味陈醇，是普洱茶陈香的重要特征香气之一。而在联苯菊酯农药存在的情况下，接种酿酒酵母、黑曲霉、产黄青霉、不接菌的情况下均未检测出甲氧基苯类化合物，说明联苯菊酯存在的情况下，不利于普洱茶陈香的甲氧基苯类挥发物的产生，不利于普洱茶的陈香气物质的形成。

结果表明，联苯菊酯农药通过影响发酵过程中部分成分的形成对普洱茶的感官质量带来不良影响，尤其是影响发酵过程中形成的挥发性香气，不同菌株固态发酵处理情况下挥发性香气物质存种类和含量存在差异，而微生物参与发酵能改善和提升普洱茶的香气。

3 结论

本研究通过在云南大叶种晒青毛茶中喷洒联苯菊酯农药来研究联苯菊酯农药对香气物质的影响及分别接种酿酒酵母、黑曲霉、产黄青霉、不接菌4种处理方式对普洱茶发酵过程中香气物质的影响。

结果表明，联苯菊酯用药前后晒青毛茶香气物质存在差异。联苯菊酯药后2 h晒青毛茶中检测出14种新产生的独有的挥发性物质，联苯菊酯药前和联苯菊酯药后2 h晒青毛茶中共有组分有32种，说明联苯菊酯能诱导晒青毛茶内含挥发性香气物质发生变化。联苯菊酯药后产生的挥发物在种类和数量上都有很大的变化，挥发物的种类发生变化（药前晒青毛茶中存在的14种香气物质在药后2 h未检测到，并且新产生14种香气物质）、含量上升（178.89%上升至244.25%），各组分占所有检测到的物质的比例也发生变化，并且对于同一种化合物二者（药前和药后2 h晒青毛茶）在含量上也存在很大差异，有增有减。各挥发物组分在施用农药后相对含量的变化情况不同，这可能是由于其合成途径的差异造成的。

不同类别的挥发物相对含量所占比例存在着差异，主要以醇类、酯类、酮类、萜烯类、含氮类、烷烃类挥发物为主。OTTENEDER H等[32]研究表明，农药残留物质不利于含氮化合物和硫化物的转化，甚至产生一些不良代谢产物和异味物质。本研究也发现联苯菊酯药后2 h晒青毛茶中醇类、酯类、烷烃类、萘、其他类挥发物极显著的高于联苯菊酯药前晒青毛茶，而酮类、萜烯类、含氮类挥发物变化不明显；药前和药后2 h晒青毛茶中相对含量最大的是叶绿醇、芳樟醇、α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、水杨酸甲酯。说明联苯菊酯能诱导醇类、酯类、烷烃类、萘、其他类挥发物含量的增加，对酮类、萜烯类、含氮类挥发物的影响不明显。

4种发酵处理情况下挥发性香气物质存在差异。不接菌的普洱茶发酵后期出现7种新物质、接种酵母菌发酵后期出现9种新物质、接种黑曲霉发酵后期出现13种新物质、接种产黄青霉发酵后期出现19种新物质，说明接种微生物能增加香气物质的种类，并提升普洱茶的香气，关于香气物质增加原理有待进一步深入研究。接酵母菌发酵的普洱茶中具有丁香花气味的1-石竹烯含量（20.09%）最高，具强的木香、花香、萜香、青香气芳樟醇（3.27%）、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅰ，3.13%）、环氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ，3.53%）、具有令人愉快的气味，类似于薄荷、樟脑味的长叶薄荷酮（0.30%）等香气物质的含量都高于接种黑曲霉、产黄青霉的普洱茶中，而接种3株菌的普洱茶中这些香气物质含量都高于不接菌的普洱茶。其中，接种酵母菌的普洱茶花果香显著，香气最好。