兔部分损伤前交叉与内侧副韧带差异环状RNA的筛选与功能分析*

陈思远 谷慧凝 韩银河 张明正 李 彬 温 昱△

（中国医科大学，1 基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳 110122；2 附属盛京医院关节外科与运动医学科，沈阳 110022）

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是维持膝关节稳定的重要装置，其运动损伤多见，好发于竞技体育运动项目[1]。反复扭伤后，易引起多种并发症，导致患者运动水平大幅下降[2]。ACL损伤内源性恢复难度大，且有一定的复发率[3]，手术治疗后常需二次翻修[4]。相比ACL，内侧副韧带（medial collateral ligament，MCL）具有更好的自愈能力[5-6]。近期研究表明，虽然ACL也存在一定的自愈能力[6]，但与MCL相比，两者之间自愈能力差异的原因仍有待探究。

环状RNA是通过反向剪接形成的非编码RNA[7]，具有参与调节ceRNA网络等功能[8]，广泛参与机体的各种生理过程[9]，目前环状RNA在肿瘤[10]以及心肺疾病[11]中的研究较为深入，对环状RNA的深入研究更全面地揭示了相关疾病发生发展中的分子机制，但环状RNA在运动系统疾病中的研究仍不充分。本研究交叉探讨正常与部分损伤的ACL及MCL之间的环状RNA表达差异及其功能，旨在从转录组水平探寻ACL内源性修复障碍的可能原因，并为生物治疗新技术提供思路，拓展ACL与MCL的分子解剖学版图。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3月龄健康雄性新西兰大白兔6只，体质量2.5~3.0 kg，购自青岛康达生物科技有限公司（中国青岛）。实验兔在中国医科大学（中国沈阳）实验动物系饲养，温度23 ℃±2 ℃，12 h光暗循环。中国医科大学医学伦理委员会于2020年10月22日批准该动物实验（批准号CMU2020310）。

1.2 主要试剂

TRIzol试 剂（Life Technologies公 司）；Ribo-Zero™ Magnetic Kit（Epicentre公司）；Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit （NEB公司）；RNA clean beads（诺唯赞公司）；DNA clean beads（诺唯赞公司）；QIAquick®Gel Extraction kit（QIAGEN）；PCR引物（生工生物工程公司）；琼脂糖（Biorad）；PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Takara Bio公司）；SYBR Premix ex TaqⅡ （Takara Bio公司）；PCR引物均购自生工生物公司。

1.3 动物分组与实验模型

6只3月龄健康雄性新西兰大白兔随机选取3只作为对照组，对照组进行假手术，不损伤ACL、MCL；损伤组使用0.9 mm针头对其余三只兔双腿ACL、MCL均于股骨近端1/3处横向穿刺，随后撕裂，导致大部分（约 2/3）韧带钝性撕列。对照组与实验组在造模后1周同时取材。取材前，将兔经耳缘静脉空气栓塞处死，解剖并分离兔ACL、MCL，韧带迅速置于液氮中冻存。具体手术及取材过程如前述[12]。在ACL、MCL正常组与损伤组中各随机选取2个样本进行测序，其余样本留存进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。

1.4 环状RNA建库与测序

先 使 用TRIzol试 剂 从ACL及MCL组 织 中分别提取每个样本的总RNA，使用RiboZeroTMMagnetic Beads以及Ribo-ZeroTMMagnetic Gold Kit （Human/Mouse/Rat）去除rRNA，并去除样本中的线性RNA，打断rRNA-depleted RNA，利用反转录反应cDNA并纯化，并进行cDNA末端修复连接接头，筛选片段进行USER 酶消化和 PCR 扩增，使用琼脂糖电泳进行核酸回收，质检合成后利用Novaseq6000进行测序。以P＜0.05且差异表达倍数≥2作为筛选标准筛选各组差异环状RNA，选择各组上、下调前五的差异表达基因进行qRT-PCR验证。

1.5 qRT-PCR验证

使用TRIzol试剂从韧带组织中提取每个样本的 总RNA。使 用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Premix ex TaqⅡ试剂进行逆转录和qRT-PCR检测。采用β-actin作为内参对照，所用引物序列见表1。为了定量分析差异表达，数据采用2-ΔΔCt法处理，所有环状RNA的表达均为β-actin的相对倍数变化，每个样本重复3次。

1.6 差异表达环状RNA生物信息学分析

基于以下数据库对基因功能进行注释：京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库；基因本体论（Gene Ontology，GO）。使用topGOR软件包进行GO富集分析，并使用Kobas软件检测KEGG通路的富集。根据GO富集分析与KEGG估计分析结果，将ACL损伤后与MCL损伤后的两组差异环状RNA进行对比。

1.7 差异环状RNA-miRNA-mRNA网络构建

通过以下条件筛选可信的ceRNA关系对。①ceRNA之间相同的miRNA数量应大于5。②超几何检验的P值小于0.01，校正后的FDR值小于0.01。③共表达分析结果指向一个ceRNA共表达网络，其中2个ceRNA彼此共表达。基于ceRNA网络，使用Cytoscape软件提取各差异组合的关系对。利用CytoHubba插件鉴定每组前10个节点。

1.8 统计学处理

所有统计数据均以±s表示。采用GraphpadPrism 8统计软件进行t检验。P值＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 环状RNA原始数据统计分析

将新西兰大白兔分为正常组与损伤组，随机选取8个样本对其环状RNA表达谱进行全面测序。将进行质量控制与质量评估后的8个样本的测序结果与新西兰大白兔基因组样本进行对比，得到测序数据在指定基因组上的位置并使用软件CIRI进行环状RNA预测。以FC＞2且P＜0.05作为标准筛选出4种对比组之间的差异环状RNA。分析环状RNA在两组样品间的表达水平差异程度及其假设检验，结果表明筛选出的各组差异circRNA 满足筛选条件。对筛选出的环状RNA做层次聚类分析，结果表明同一总体不同样本中的环状RNA表达略有差异，但总体表达趋势相近，符合逻辑。各组共筛选出308个差异环状RNA，其中123个上调，185个下调（表2）。

表1 引物序列

表2 各对比组差异表达环状RNA数量

2.2 差异表达环状RNA验证

对筛选出的差异表达环状RNA进一步进行qRT-PCR验证表达差异，分别选择了4个对比组中的前5个上调与前5个下调环状RNA进行验证，此40个环状RNA的qRT-PCR表达趋势均与测序结果相一致（图1）。

图1 各差异表达环状RNA在两种样本中的表达量差异

2.3 差异表达环状RNA GO分析

绘制差异环状RNA来源基因GO分析柱状统计图（图2）。分析各2级分类下所有环状RNA与各组差异环状RNA的不同富集趋势，各组总环状RNA与差异环状RNA均富集于细胞进程、生物调节、细胞、细胞组分、细胞汇集以及催化活性能。

在ACL正常样本与损伤样本对比组中，差异环状RNA在组织或生物体的细胞组成部分、迁移、超分子复合体、信号传感器活动、分子传感器活动（以及细胞连接功能方面表现出较总环状RNA更高的富集水平。

在MCL正常样本与损伤样本对比组中，差异环状RNA在细胞杀伤、病毒体、病毒体组分、信号传感器活动（以及分子传感器活动功能方面表现出较总环状RNA更高的富集水平。

在MCL正常样本与ACL正常样本对比组中，差异环状RNA在细胞行为、生长、突触、拟核、信号传感器活动以及分子传感器活动功能方面表现出较总环状RNA更高的富集水平。

在MCL损伤样本与ACL损伤样本对比组中，差异环状RNA在免疫系统进程、生长、病毒体、病毒体组分、分子功能调节器以及转录因子活动与蛋白结合功能方面表现出较总环状RNA更高的富集水平。

2.4 差异表达环状RNA KEGG分析

进一步运用Cluster Profiler分析差异表达环状RNA来源基因在KEGG代谢通路数据库中各通路的富集情况（图3）。

通过KEGG分析，在ACL正常样本与损伤样本对比组中，差异环状RNA在人类巨细胞病毒感染及抗原加工与呈递通路中富集程度最为显著。差异环状RNA在内吞作用及RNA降解通路中数量最多。

在MCL正常样本与损伤样本对比组中，差异环状RNA在NF-κB信号通路及人类巨细胞病毒感染通路中富集程度最为显著，也在此两者通路中数量最多。

在MCL正常样本与ACL正常样本对比组中，差异环状RNA在JAK-STAT 信号通路中富集程度最为显著，也在此通路中数量最多，且可信度也最高。

图2 差异表达环状RNA GO分析结果。横坐标为GO分类，纵坐标左侧为基因数目所占百分比，右侧为基因数目。深色柱代表差异环状RNA基因，浅色柱代表所有环状RNA。A： ACL正常组vs ACL损伤组；B： MCL正常组vs MCL损伤组；C： MCL正常组vs ACL正常组；D： MCL损伤组vs ACL损伤组.图3 差异表达环状RNA KEGG分析结果。图中每一个圆表示一个KEGG通路，纵坐标为通路名称，横坐标为差异环状RNA的富集因子，即差异环状RNA中注释到该通路的基因比例与所有环状RNA中注释到该通路的基因比例的比值。圆圈的颜色代表P value。圆圈的大小代表环状RNA数目。A： ACL正常组vs ACL损伤组；B： MCL正常组vs MCL损伤组；C： MCL正常组vs ACL正常组；D： MCL损伤组vs ACL损伤组.

在MCL损伤样本与ACL损伤样本对比组中，差异环状RNA在胰腺分泌及胰腺肿瘤通路中富集程度最为显著。差异环状RNA在内吞作用通路中数量最多。

2.5 差异表达环状RNA-miRNA-mRNA网络

图4 差异表达环状RNA-miRNA-mRNA网格

环状RNA作为ceRNA网络的重要组成成分，可以与miRNA结合，减弱其对mRNA翻译蛋白的抑制作用。分析各组差异circRNA的下游miRNA与靶基因，利用Cytoscape软件绘制网络，并利用cytoHubba软件中的MCC算法筛选出各组网络图中相关度最高的前10位基因，绘制网络图（图4）。

3 讨论

ACL与MCL损伤后两组差异环 状RNA来 源基因富集通路的不同点主要集中在4个方面。①在损伤组织的修复过程中需要生成新的血管[11]，并募集巨噬细胞[13]，促进损伤组织的修复。在GO分析中，ACL损伤后主要富集于抑制血管生成相关通路，总量达到促进血管生成相关通路的2倍多。MCL损伤后则无抑制血管生成相关通路的富集。②修复性炎症可以清除坏死组织，为组织修复重建创造有利环境，但过度的炎症反应会引起纤维化，出现修复缺陷[14，15]。ACL与MCL的差异环状RNA可能从不同途径参与了炎症反应。KEGG分析结果显示，ACL损伤后约1/3通路与炎症相关，而MCL则不到1/6，且二者仅有一条相同的富集通路，存在较大差异。有证据表明，ACL损伤后炎症反应失调，导致了愈合障碍及骨关节炎[16]，而相关环状RNA的表达差异可能为其原因之一。③组织损伤后，多种细胞被募集参与修复过程[17，18]。GO分析结果显示，两组均不同程度的富集于促进细胞增殖的通路中，ACL有11条通路，MCL有14条相关富集通路。ACL损伤后也有部分富集于4条细胞周期阻滞通路中，而MCL没有，这些环状RNA的功能以及其是否能作为ACL内源性修复障碍的因素之一仍有待探究。④在mRNA转录与蛋白翻译KEGG相关通路中，两组均在mRNA降解通路中明显富集。然而相较MCL损伤后相关环状RNA呈下调趋势，ACL损伤后差异环状RNA则明显上调，两者截然不同的表现可能进一步导致了二者自愈能力的差异。

在ce RNA网络中，NC_013686.1：35078653|351在ACL损伤后与MCL损伤后的差异ceRNA网络中相关度均较高，下游靶向EFCC1、PKP4、ARHGAP44、STUM基因，提示可能与免疫细胞衰老[19]、本体感受神经元的机械传感密切相关[20]。在MCL损伤后的差异ceRNA网络中STUM为中心靶基因，而NW_003159656.1：66918|127907相关度最高，可调节多个miRNA，其在ACL损伤后却无差异，提示可能为ACL与MCL修复能力差异的原因之一。NC_013686.1：35078653|351与NW_003159656.1：66918|127907可能在ACL与MCL修复中扮演着重要角色。

本研究也存在着一定的不足，环状RNA数据库十分庞杂，由于时间与条件的限制，本研究仅进行了初步的理论分析与差异验证，具体环状RNA在ACL修复中的作用以及ACL可能的内源性修复机制仍待探究。