高效液相色谱测定葡萄糖酸钙片含量和溶出度的方法研究

邓映明，张 雁，曾玉梅，刘志辉（通信作者）

（梅州市食品药品监督检验所化学室 广东 梅州 514071）

葡萄糖酸钙片在临床上广泛用于补充钙质，治疗钙缺乏症，如骨质疏松、佝偻病[1-2]以及与其他药物联用用于产后出血、小儿厌食等[3-6]。葡萄糖酸钙片现行标准为《中国药典》2020 年版二部，其含量测定方法以钙紫红素为指示剂，EDTA 滴定液滴定至紫色转变为纯蓝，滴定钙的含量，换算为葡糖糖酸钙的含量；溶出度采用原子吸收分光光度法测定其溶出量，原子吸收分光光度法重现性较差。现有文献报道葡萄糖酸钙含量测定方法主要包括电位滴定法、离子色谱法、ICP-OES、ICP-MS等[7-16]，本文基于高效液相色谱技术对葡萄糖酸钙片的含量和溶出度测定方法进行了研究，建立了HPLC 法测定葡萄糖酸钙片的含量和溶出度。该方法灵敏度高、不受辅料干扰、操作简单、结果准确，且成本低，可为该药品的质量控制提供参考。

1.仪器与试药

Agilent 1200 高效液相色谱仪，Agilent 1200 紫外检测器；SOTAX 半自动溶出仪；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。葡萄糖酸钙对照品（批号100082-201002，含量：99.8%，中国食品药品检定研究院）；葡萄糖酸 钙 片（厂 家A 批 号：2109031、2109012、2010014，厂 家B 批 号：77220503、77220203； 厂 家C 批 号：20211101、20210401，厂家D 批号：3220512、3220214、3220409，厂家E 批号：11220607 厂家F 批号：211201、210609、210104）。

2.方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1色谱条件与溶液制备 （1）色谱条件。色谱柱：安捷伦ZORBAXSB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：0.05 mol·L-1磷酸二氢钾（磷酸调节pH 至2.8），流速0.5 mL·min-1，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量：10 μL。（2）对照品溶液的制备。精密称取葡萄糖酸钙对照品55.30 mg 于2 5 mL 量瓶中，加水振摇使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液。精密量取对照储备液2 mL 置10 mL 中，摇匀，作为对照品溶液。（3）供试品溶液的制备。取葡萄糖酸钙片10 片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于葡萄糖酸钙50 mg），置100 mL 量瓶中，加水30 mL，超声10 min 使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。（4）阴性样品溶液的制备。按葡萄糖酸钙片处方比例（辅料为滑石粉、羧甲基淀粉钠、蔗糖、硬脂酸镁），制作除葡萄糖酸钙外的阴性样品，并按（2）项下方法制备阴性样品溶液。

2.1.2 实验 （1）系统适用性实验。取对照溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，按2.1.1 中的（1）项下色谱条件依次进样，记录色谱图。结果显示供试品溶液主峰保留时间与对照品主峰保留时间一致，理论塔板数以葡萄糖酸钙峰计为15 000 以上。（见图1）。（2）专属性实验。分别吸取上述供试品溶液、对照溶液、含辅料阴性样品溶液，按照“2.2.1”色谱条件，记录色谱图。实验结果阴性样品溶液在与葡萄糖酸钙相应的保留时间处，无色谱峰出现，表明辅料不干扰葡萄糖酸钙的测定，见图1。（3）线性关系与检出限。①分别精密量取上述对照品储备液0.5、1、2、5、10 mL 于1 0 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，配制成0.1103、0.2207、0.4414、1.1035、2.207 mg·mL-1的葡萄糖酸钙系列标准溶液.②按2.1.1中的（1）色谱条件进行测定，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，系列标准溶液浓度X 为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程Y = 638.45X+9.0113，r= 0.9996。结果表明：葡萄糖酸钙在0.1103 ～2.207 mg·mL-1范围内与峰面积呈现线性关系良好。③量取对照溶液适量，加流动相逐级稀释，以S/N = 3 时为检测限。测得检测限为3.8 ng，以S/N = 10 确定定量限为12.8 ng。（4）精密度试验取系列标准溶液下浓度为0.220 7 mg·mL-1的对照溶液，按按2.1.1 中的（1）项下色谱条件连续进样6 次，其峰面积平均值为309.1，RSD 为0.1%。（5）重复性试验。取厂家B 样品（批号：77220503）的葡萄糖酸钙片，按（3）方法制备样品进样，平行测定6 次，平均含量为99.76%，RSD 为0.2%。（6）稳定性试验。取厂家C 样品（批号：20211101），制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、12，24 h 后测定，葡萄糖酸钙的峰面积RSD 为0.3%。试验结果表明，供试品溶液配制好后24 h 内稳定。（7）回收率试验。称取已知含量的葡萄糖酸钙片（批号：2109031，含量：947.12 mg/g）研细，称取细粉适量（约相当于葡萄糖酸钙20、25、30 mg 各3 份）置1 0 0 mL 量瓶中，共9 份，分别精密称取葡萄糖酸钙对照品（含量：99.8%，约20、25、30 mg 各3 份）置同一量瓶中，按含量测定方法测定含量，结果平均回收率为100.54%，RSD为0.74%。回收率试验结果见表1。（8）样品含量测定精密称取6 各厂家14 批次的样品细粉，按供试品溶液项下制备方法制备含量测定样品，按照“2.2.1”项下色谱条件，进行含量测定，并与容量滴定法进行比对，结果显示两种方法含量测定结果相近，见表2。

表1 回收率试验结果

表2 两种方法含量测定结果比较（n = 3）

图1 HPLC 色谱图

2.2 溶出度测定

2.2.1 测定方法 取葡萄糖酸钙片6 片，溶出介质为水1 000 mL，浆法，转速为每min50转，温度为37±0.5 ℃，照溶出度与释放度测定法（《中国药典》2020 年版四部通则0931），依法操作，经45 min，取溶液适量，滤过，取续滤液作为溶出度测定供试品溶液。

2.2.2 累积溶出量曲线的绘制 取6 片样品（批号：2109012），按“2.2.1”方法进行操作，分别于10、15、20、30、40、45、50、55 min 时取样5 mL（同时补充溶出介质5 mL），滤过，取续滤液，按“2.1.1”色谱条件进样，计算溶出量和平均累积溶出量，绘制累积溶出量曲线，测定结果表面45 min 后溶出曲线趋于平稳，样品溶出量接近100%，见图2。

图2 葡萄糖酸钙片溶出曲线

2.2.3溶出度均一性考察 取厂家A 样品（批号：2109012），按“2.2.1”方法平行操作6 次，计算葡糖糖酸钙平均累积溶出量，绘制其6 次溶出曲线，得溶出均一性结果，结果显示，6 次溶出试验的曲线趋势基本相同，至45 min 时的累积溶出量RSD 为0.85%。见图3。

图3 溶出均一性结果（n = 6）

2.2.4 溶出度测定 取上述6 个厂家各1 批次样品，分别按“2.2.1”方法操作，结果6 批次样品在45 min时的溶出量均大于75%，见表3。

表3 样品在45 min 时的溶出量（%）

3.讨论

检测波长的选择。葡萄糖酸根有羰基氧和羟基氧上孤对电子的共轭作用所产生的末端吸收（205～215 nm），波长210 nm 处溶剂及辅料对葡萄糖酸钙的测定不产生干扰，故选择210 nm 为检测波长。

流动相的选择。葡萄糖酸为有机酸，极性较大，在反相柱上保留较弱，为增加葡萄糖酸钙的保留，故采用水性柱和纯水相作为流动相，由于磷酸盐在紫外区几乎无吸收，故选择缓冲液；缓冲液的pH 对葡萄糖酸钙的峰形影响较大，pH 较大时，葡萄糖酸发生酸式解离，造成峰拖尾，pH 减小由于抑制了葡萄糖酸的解离，峰形变锐，有利于准确定量；本实验采用了0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（pH = 2.8）作为流动相，结果显示，葡萄糖酸峰峰形好，柱效高，保留时间合适。

提取方法的选择。采用流动相作为提取溶剂有利于充分提取葡萄糖酸钙，但是葡萄糖酸钙溶液不稳定，30 min 后会发生降解。根据葡萄糖酸钙在水中缓缓溶解的物理性质，可采用简便、快速的超声提取的方式，该方式同样可以充分提取葡萄糖酸钙，且葡萄糖酸钙水溶液在24 h 内稳定。