PK/G6PD活性比值在丙酮酸激酶缺乏症诊断中的意义*

胡国霞 李津杞 李津婴 查占山 屠晓华 钱宝华 杨江存

丙酮酸激酶缺乏症（pyruvate kinase deficiency，PKD）是糖酵解途径中最常见的常染色体隐性遗传酶缺陷引起的先天性溶血性贫血。丙酮酸激酶缺乏的红细胞，变形能力降低容易发生溶血[1-2]。PKD病情严重程度差异很大，从胎儿水肿伴宫内死亡到偶然发生的无症状完全代偿性溶血，再到出生到老年的严重输血依赖性贫血甚至危及生命[3]。1961年，VALENTINE首次将PKD描述为遗传性溶血性贫血的病因[4]。BEUTLER对白种人PKD的患病率估计1/20 000～1/300 000，变化范围较大，这可能是因为PKD确诊困难且真正患病率尚不清楚[2，5]。PKD诊断标准的组成主要是临床诊断和实验室诊断。到目前为止，PKD缺少提示本病的特征性临床诊断线索。实验室诊断主要依靠PK活性或基因检测。然而，很多因素影响PK活性检测，如标本储存条件、白细胞和血小板污染、网织红细胞计数增高、近期输血、患者的年龄、无症状杂合子携带者、PK特殊变异型等影响及PK活性质量控制试剂没有商业来源等；另外，基因检测也不能完全确诊PKD[6-7]。因此，为了减少PKD漏诊和误诊，本文通过研究40例PKD患者相关指标并进行统计学分析，以期找出对PKD有诊断价值的参考数据。

资料与方法

1 研究对象及诊断标准

1.1 研究对象：收集自2015年1月～2022年1月在本院做红细胞相关酶检测的812例门诊或住院患者，其中PK活性降低的有164例，家系验证确诊PKD有23例，基因验证确诊PKD有17例，最终确诊40例PKD作为患病组，并将32例健康体检者作为正常对照组。所有被检者检测血常规、网织红细胞百分数。

1.2 PKD诊断标准：诊断标准包括临床诊断和实验室诊断。诊断金标准为特异底物条件下的酶催化活力测定。PK活力测值下降并符合临床诊断2项以上可诊断为PKD；临床诊断低于2项、实验室诊断特异性指标异常且通过家系验证后可确诊PKD；高度怀疑的疑难病例，溶血全套排查试验仍不能确诊，基因检测出有明确致病性的PKLR基因突变可确诊PKD[8]。

1.3 仪器及试剂： Wright's-Giemsa染液（珠海贝索生物技术有限公司）、光学显微镜（OLYMPUS，Ch20BIBF200）、离心机（Thermo,ST-40R）、紫外可见分光光度计（756-UV，上海三分厂生产）、恒温循环水槽（DC-0530，宁波新芝科技公司）。仪器按照说明书操作。酶试剂按照《溶血性疾病》相关要求配制[9]。

2 研究方法

2.1 病史采集：收集患者及父母既往病史和现病史资料。疑难病例标本送基因检测机构进行红系相关疾病panel分析并对家系行Sanger验证。病历系统资料显示18例PKD患者PKLR基因有突变，系统登记了12例患者PKLR基因突变类型，发现12例PKD患者的PKLR基因有9个位点突变及3个小片段缺失，部分患者基因检测资料未知。

家系（指患者父母）PK活性低下的有41例，其中患者父亲PK活性低下有23例，比例56%；患者母亲PK活性低下有18个，比例44%；患者父母亲PK活性都低下有16例，比例39%。所有家系中位年龄30岁（19～50岁），PK活性为：（9.5±3.1）U•g-1•Hb-1，G6PD活性为:（10.7±1.7）U•g-1•Hb-1。

2.2 外周血形态镜检：新鲜静脉血制作血涂片Wright's-Giemsa染色后，镜检形态异常红细胞。2015年ICSH（International Committee for Standardization in Haematology）指南指出，正常红细胞平均直径为7.5 μm，呈圆形或略椭圆形，中央淡染区约占整个细胞体积的三分之一，并建议评估至少1 000个红细胞，以提供具有特定形态异常细胞的精确百分比[10]。红细胞镜检内容主要是检查细胞大小、体积、染色及是否有异常细胞。红细胞形态异常包括：红细胞大小异常、体积异常、染色异常及有异常细胞。可在PKD患者外周血镜检时发现棘球红细胞，又称毛刺细胞，其形态特征呈非圆盘状，细胞表面覆盖着10～30个短而钝的突起或针状物。ICSH建议对外周血的棘球红细胞分级，棘球红细胞＜5%为1级，5%～20%为2级，＞20%为3级。各个分级分别代表棘球红细胞的增多程度：1级代表少见/罕见、2级代表中度多见、3级代表显著多见[11]。

2.3 酶活性检测：采集肝素抗凝静脉血5 mL，根据《溶血性疾病》中相关要求和ICSH推荐方法进行酶活性检测并计算本实验室酶活性参考范围[9,12-13]。

3 统计学方法 应用SPSS 26统计软件分析,符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和率表示；计算Pearson相关系数估计PK与PK/G6PD比值之间的相关性，并使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析PK/G6PD比值对PKD的诊断准确度；P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 PKD患病组临床资料和溶血相关性指标及红细胞形态特征 40例PKD患者包括来自不同家族和同一家族,男女比例1.1∶1。年龄≥18岁的成年患者26例，儿童患者5例，3岁以下婴幼儿患者9例。患者是否黄疸、脾大、胆结石、贫血、输血及切脾，见表1。PKD患者的红细胞形态特征通常不显著，表现出一定程度的异常细胞。本次报道中38例红细胞形态异常PKD患者中，20例有棘球红细胞，1级棘球红细胞PKD患者有9例，比例45%，2级棘球红细胞PKD患者有9例，比例45%，3级棘球红细胞PKD患者有2例，比例10%。其中在3级棘球红细胞PKD患者中，有1例PKD患者进行了脾切除手术，脾切除术前的棘球红细胞表现轻微；而脾切除术后，细胞深染更为突出、特征性棘球红细胞更明显，见图1。

表1 PKD患病组临床资料及红细胞形态

2 PKD患病组与正常对照组PK/G6PD比值和各血象指标的比较 与正常对照组相比较，PKD患病组的PK/G6PD比值（P＜0.01）、红细胞计数（P=0.03）、网织红细胞百分数（P=0.01）差异有统计学意义；而血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板计数差异均无统计学意义，见表2。另外，PK/G6PD比值与PK的Pearson相关系数是0.913（P＜0.01）。以PKD患者为因变量，以PK活性、PK/G6PD比值为自变量进行ROC曲线分析，结果显示PK活性的曲线下面积（AUC）是0.978（95%CI：0.950～1.005），PK/G6PD的AUC是0.972（95%CI：0.941～1.002），见图2。散点图直观显示两组之间的差异，见图3。说明PK/G6PD比值诊断PKD的准确度与PK活性相当。

图2 PK活性、 PK/G6PD比值诊断PKD的ROC曲线

图3 PKD患病组与正常对照组PK活性、PK/G6PD比值散点图

表2 正常对照组与PKD患病组实验室指标比较

图1A 脾切除术前PKD患者棘球红细胞（×1 000倍）

图1B 脾切除术后PKD患者棘球红细胞（×1 000倍）

3 家系杂合子组与非家系杂合子组PK/G6PD比值、Ret结果比较 40例PKD患者中有28例进行了基因检测，PKLR基因突变有18例，包括：家系杂合子有9例，非家系杂合子有7例，纯合突变1例，突变意义未明1例。9例家系杂合子患者作为家系杂合子组，7例非家系杂合子患者作为非家系杂合子组。与非家系杂合子组相比较，家系杂合子组的PK/G6PD比值、Ret差异有统计学意义（P＜0.05），而PK活性差异无统计学意义（P=0.12），见表3。

表3 家系杂合子组与非家系杂合子组的PK活性、PK/G6PD、Ret比较

讨 论

本次报道的40例PKD患者65%是成年人，比宋琳、李园等报告的近50%要高，可能是由于我们收集到的大部分病例都是外院未确诊的疑难患者，轻症疑难患者一般无症状，所以导致就诊年龄偏大；另一方面也说明年龄越大的PKD患者耐受程度更高[14]。因为2,3-二磷酸甘油酯（2,3-DPG）使氧解离曲线右移，PKD患者PK酶反应上游积累了2,3-DPG，所以尽管贫血，组织的氧送仍有改善，或者Ret增高导致造血代偿，使得患者通常有较好的输血阈值。因此，PKD患者临床表现异质性较大，但如遇急性感染、药物和怀孕等会加剧溶血，详细询问病史有助于诊断[15-17]。

对制作、染色良好的血涂片镜检，是诊断红细胞溶血性疾病的重要组成部分，也是识别红细胞形态学异常的基本方法。我们观察到的20例PKD患者的棘球红细胞比正常红细胞小，边界不规则，缺乏中央淡染区，仅有50%PKD患者外周血镜检中发现了棘球红细胞，说明PKD的红细胞形态通常不显著。在PKD患者中可以观察到不同比例（3%～30%）的棘球红细胞，尤其是脾切除术后[2]。棘球红细胞代表脱水的、耗尽ATP（三磷酸腺苷）的红细胞；ATP水平迅速下降，红细胞失去钾和水变得干燥、粘稠、有毛刺，在脾脏中被破坏[18]。虽然棘球红细胞是PKD的非特异性特征，但是在脾切除术后尤其明显，所以棘球红细胞在诊断PKD时可以起到一定的提示作用[2]。

PKLR基因检测适合新生儿或胎儿进行产前诊断、杂合子携带者及输血后的检测等。然而，这种技术的缺点是所发现的突变中约有20%尚未归类为致病突变；另外，高达10%的患者有常规外显子测序未检测到的变异体，有一部分PKD患者在PKLR的非编码区存在隐性突变，这些突变在基因测试中被遗漏；现有的检测工具无法解释内含子或基因调控区变体的临床意义而且分子检测成本高昂、耗时、费力[15，19-20]。鉴于目前PKD诊断的局限性和疾病的广泛表型特征，需要更敏感的生物标志物。对于PKLR突变意义未明的患者，必须进行PK活性测定。因此，筛选一种方便、快捷、廉价、敏感的PKD的检出方法显得尤为重要。通过分光光度法测定红细胞裂解物中PK活性，速度相对较快，只需2～3小时的实验室工作就可以完成测试，而且价格低廉。

已有研究报道PK与己糖激酶（hexokinase, HK）比值可以诊断PKD，有极好的敏感性，比PK活性更敏感，甚至比PKLR外显子序列更敏感地诊断PKD，可校正PK酶活性假阴性患者的测定结果,PK与红细胞年龄依赖性酶活性比值可被视为PKD诊断评估的标准组成部分，从而减少PK活性假阴性的影响因素[19]。PK、G6PD、HK的活性与红细胞年龄有关，如果PK活性正常或低下，但另一个红细胞年龄依赖性酶活性增加，且PK和此酶的活性比值降低，则提示PK缺乏[1，21]。相比较HK，一般常规实验室测定G6PD活性更常见，故我们选择PK和G6PD的活性测定，PK/G6PD活性比值明显降低应高度怀疑是PKD。本研究中40例PKD患者中有38例PK活性低，5例G6PD活性高，37例PK/G6PD比值低，对PKD的诊断敏感性为93%；且家系杂合子PK/G6PD比值更低，与非家系杂合子相比差异有统计学意义。在高网织红细胞计数的情况下，任何缺陷酶都可能表现出正常或增加的酶活性[19]。而家系杂合子患者的网织红细胞升高不明显，PK/G6PD比值更能反映患者的真实状态。

总之，本研究提示PK/G6PD比值与PK活性具有同等的诊断价值，尤其适用于网织红细胞增高、依赖输血的患者。在常规PK活性筛查中，同时测定PK和G6PD活性可以提高PKD诊断率。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突