雷公藤甲素致生殖细胞凋亡的研究进展

李昕融，杨大航，黄凤娇，朱文全，黄愉淋*

（1.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学护理学院，广西 南宁 530200）

雷公藤甲素（triptolide，TP）又被称为雷公藤内酯醇，它是从雷公藤（tripterygium wilfordii Hook.f.）中提取鉴定出来的环氧二萜内酯化合物。雷公藤在中医药的运用具有悠久历史，TP 在雷公藤内含量较高，具有调节免疫系统、抗炎、抗肿瘤等功能，对多种癌症如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等均有良好的抑癌作用［1］。然而，因为TP 对机体生殖系统具有毒副作用，如可抑制雄性生物生精细胞、睾丸间质细胞、睾丸支持细胞的生长发育，从而导致雄性生殖能力下降甚至不育；对于雌性生物，TP 可促进卵泡闭锁及卵母细胞、卵巢颗粒细胞凋亡，从而导致雌性生殖能力下降，因此，TP在临床医学上的应用受到了严重限制。本文就雷公藤甲素致生殖细胞凋亡的研究进展综述如下。

1 对雄性生殖细胞的影响

大量临床试验表明TP药理活性较强且毒性较大，可以导致细胞突变，还可使雄性生育能力降低。主要通过促使睾丸萎缩、降低睾丸的脏器系数这两种方式减少各级生精细胞和精子数量，并促使这两类细胞变性、坏死，该药物还可以通过毒性蓄积产生抗生育作用［2］。

1.1 对生精细胞的影响 睾丸生精细胞主要包括精原细胞、精母细胞和精子细胞，生精细胞跟精子发生的联系最密切，各级生精细胞的死亡可以使男性精子数量减少、精子活力降低甚至不育［3］。TP不仅能抑制生精细胞的增殖［4］，而且所导致的睾丸生精细胞损伤具有细胞选择性［5］。李博怿研究发现，雷公藤甲素可以通过使SCF（干细胞因子）、c-kit（干细胞生长因子受体）表达增加来促进精母细胞的凋亡［6］。吴建元等［7］研究结果显示，长期服用雷公藤多苷片可能促使核转录因子NFκB 表达过度抑制，使睾丸精母相关凋亡基因表达上调，导致细胞凋亡。邱鲁阳等［8］对小鼠进行雷公藤多苷灌胃后，发现Piwil2、Stat3 及Bcl-2 蛋白在雄性小鼠睾丸组织生精细胞及间质细胞中的表达量均显著降低，小鼠表现为不育。且三种蛋白在生精小管（包括生精细胞）及间质细胞内的表达位置存在相关性。Piwil2、Stat3及Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达量显著降低，说明雷公藤多苷可促进小鼠的雄性生殖细胞凋亡。修晓宇等［9］研究发现，细线期初级精母细胞可能对雷公藤甲素反应最为敏感。WANG 等［10］研究发现雷公藤甲素可促使体内培养或体外培养环境中的活性氧簇（ROS）水平提高，并以此破坏睾丸支持细胞内的氧化还原平衡从而激活JNK 通路，使精母细胞凋亡。ZHANG 等［11］研究发现雷公藤甲素可以通过抑制SC 中依赖 Sp1 的 PFKP 表达，从而抑制 GATA4 介质糖解，并产生睾丸毒性，使精母细胞凋亡。

1.2 对睾丸支持细胞的影响 睾丸的精曲小管由支持细胞和生精细胞共同构成，支持细胞在结构上为生精细胞的分化和成熟提供了支架的作用，供给其生精过程所需的能量和相关的一系列营养物质，同时可分泌调节蛋白类、转运蛋白类、生长因子类、类固醇类等十多种物质参与生精细胞的分化和成熟，具有精细的协调作用，可使精子发生的环节正常有序进行［12］。雷公藤甲素可使小鼠睾丸支持细胞氧化应激水平上调，使Akt和p70S6K 激活，可能通过此种方式促进生殖细胞凋亡［13］。雷公藤多苷具有抑制睾丸支持细胞G1期及S 期分裂的作用，从而可影响雄激素结合蛋白的分泌并抑制生精细胞的发生，促进生精细胞的凋亡［14］。雷公藤多苷引起的支持细胞和间质细胞的结构改变会使性激素分泌水平发生改变，从而影响生精细胞的凋亡率［15］。除此之外，雷公藤多苷可以促进睾丸支持细胞Fas 促凋亡基因的表达［16］，可能调控支持细胞骨架蛋白的表达，促进生殖细胞的凋亡［17］。

1.3 对睾丸间质细胞的影响 叶小云等［18］用不同浓度（50、100、200 nmol/L）的TP 处理TM3 细胞（小鼠睾丸间质细胞），对照组采用0.1%浓度DMSO（二甲基亚砜）的等体积无血清培养液，在经过37 ℃恒温孵育箱培养24 h 后，发现对照组LDH 的活性随TP 浓度升高显著增强，TP 各浓度组凋亡率与对照组比较均上调，其中200 nmol/L 组与对照组比较差异显著（P＜0.05），另外，与对照组相比，pAMPK/AMPK 比值明显降低，p-Akt/Akt 比值和p-mTOR 磷酸化水平均升高。由此可知雷公藤甲素可以通过影响睾丸间质细胞活性，使AMPK 抑制和Akt/mTOR 通路活化，通过氧化应激诱导睾丸间质细胞凋亡。

2 对雌性生殖细胞的影响

2.1 雷公藤甲素对卵巢及卵母细胞毒性的作用 卵巢是雌性动物的生殖器官，卵母细胞由卵巢产生，卵母细胞发育及成熟情况对雌性生殖具有重要影响。阮秦莉等［19］将年轻成虫期秀丽隐杆线虫随机分为空白组、雷公藤甲素组及补肾活血汤组（62.5、125、250 mg/ml），雷公藤甲素构建秀丽隐杆线虫卵巢储备功能下降模型，补肾活血汤分别处理24、48和72 h后，统计后代的数目、子宫内受精卵的数目、未受精卵母细胞的数目、有丝分裂区的细胞数目、凋亡细胞以及卵母细胞数目，采用RT-PCR 测定细胞凋亡通路相关基因的mRNA 表达水平，结果发现雷公藤甲素可以导致秀丽隐杆线虫ced-3 基因表达水平升高并降低ced-9 基因表达水平，从而提高卵母细胞的凋亡率。刘宴娟等［20］研究发现，雷公藤甲素导致的ERK/c-fos 异常表达可能会促进仓鼠卵巢细胞凋亡。

2.2 雷公藤甲素对卵巢颗粒细胞凋亡的影响 随着生殖细胞凋亡研究的不断深入，人们发现哺乳动物的卵泡闭锁实际上是GCs（卵巢颗粒细胞）凋亡的结果，而卵泡闭锁可以导致生殖功能的衰退［21］。TP 可以促进GCs 的凋亡，并且用药剂量和药物效应的相关度较高［22］。曾又佳等［23］研究发现，雷公藤甲素可能通过提高卵泡颗粒细胞的线粒体凋亡蛋白Cyt C、APAF-1表达和降低XIAP 抗凋亡蛋白的表达来促进卵巢颗粒细胞的凋亡。研究显示，雷公藤甲素在质量浓度为30 μg/L时GCs凋亡率出现了明显上升的情况，质量浓度在100 μg/L及200 μg/L时GCs凋亡率反而有下降趋势，此种现象可能与GCs 的自我保护机制有关，且雷酚内酯在一定质量浓度范围内，随着雷酚内酯质量浓度不断增高，卵巢颗粒细胞凋亡率也随之不断升高，这些主要的雷公藤单体对细胞凋亡的影响没有呈现出明显的浓度和时间的相关效应，而是表现出一种复杂的变化现象［24］。徐丽萍等［25］研究发现，在同等剂量下，雷公藤多苷间歇给药方案对生殖功能损害作用更轻微，对雌性卵泡生殖细胞的促凋亡作用也更小。研究表明［26］，雷公藤多苷（TG）能够通过诱导内源性miR-15a 表达并抑制Hippo-YAP/TAZ 途径，对卵巢颗粒细胞具有毒性作用，会促进细胞衰老和凋亡。

2.3 雷公藤甲素对卵泡细胞的影响 卵泡是卵巢的基本功能单位。卵泡具有的特殊微环境，可以保护卵母细胞，直到卵母细胞被选择而开始生长和发生排卵［27］。郜然然［28］研究认为，雷公藤甲素可能通过下调PI3K、AKT、mTOR 信号通路中的关键蛋白p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 在细胞膜表面的表达含量而对该类通路进行抑制，用一定浓度的雷公藤甲素对大鼠进行给药，通过此机理可以构建大鼠卵泡发育障碍的体内动物模型。而马蔚蓉等［29］研究发现，雷公藤甲素不仅仅可能通过下调PI3K、AKT、mTOR信号通路中的关键蛋白p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 在细胞膜表面的表达含量来抑制卵泡细胞的发育，还有可能通过抑制Nrf-2/HO-1抗氧化应激途径来促进卵泡细胞的早衰，从而使卵泡细胞储备数量降低。林慧文等［30］实验研究发现，用雷公藤多苷片依照50 mg/kg 的给药比例每天对大鼠进行灌胃1次，进行14 d造模，造模停止15 d后大鼠状态逐渐趋向正常水平，但体内多种激素水平和卵泡细胞的凋亡率仍然保留在造模后水平，35 d 后仍未恢复正常。还可观察到用雷公藤多苷灌胃的雌性小鼠出现卵巢早衰的症状，同时卵巢早衰的大鼠表达SCF 蛋白水平有一定增高，TGF-βRⅡ、Cx-37 蛋白的表达量减少，说明雷公藤多苷可能通过影响以上几种蛋白的表达来促进卵泡细胞的凋亡［31］。陈燕霞等［32］研究表明，雷公藤多苷可以降低子宫和卵巢指数，升高FSH、LH 水平，降低E2水平，减少生长卵泡以及黄体数量并增加闭锁卵泡的数量。除此之外，雷公藤多苷还可能抑制VEGF 及其受体flt-l、kdr 蛋白的表达，以此来促进卵泡细胞的凋亡［33］。还有实验表明，雷公藤多苷可以使血清FSH、LH水平明显提高，使E2、AMH及INHB水平明显降低［34］。

3 前景与展望

综上所述，TP主要通过细胞凋亡活动对生殖细胞产生影响，最终导致精子或卵子产生过程紊乱，从而引起生殖毒性。当前研究主要集中于观察TP 引起生殖细胞某些基因或蛋白质表达水平的改变，仅仅从某一方面来研究TP生殖毒理作用，缺乏从整体的角度对其进行深入探讨，因而不能全面地说明其生殖毒性的作用靶点及调控分子机制。因此，在未来，我们希望可以通过蛋白质组学等多组学技术系统地对TP 作用前后生殖细胞进行分析，力求较全面揭示TP的生殖毒性作用机理，为其临床合理应用及其增效减毒衍生物的研发提供实验依据和理论支撑。