兽用疫苗研究进展

张广庆

（山东省泰安市岱岳区畜牧兽医事业发展服务中心，山东 泰安 271000）

从18世纪后期Edward Jenner发现接种牛痘可以保护人类免受天花感染开始，到 20世纪人类彻底消灭天花，疫苗在人类和动物的生命健康和生活幸福中发挥了关键作用[1-3]。随着世界人口的不断增长，人们对食物资源的需求量越来越大，这使得集约化养殖模式对维持食物资源的供应愈发重要。随着我国动物养殖业向集约化规模发展，集约化养殖所存在的问题不断显现，其中由集约化养殖导致的传染性病原体传播进而引起疾病发生的问题尤为显著。这不仅严重影响了我国畜牧业生产力，还在一定程度上影响国家经济的发展。此外，动物源性病原也可以通过直接接触感染动物、其组织和体液等或是以节肢动物作为媒介传播给人类（人畜共患病），进而对公共卫生安全产生巨大威胁。因此，防止传染病在动物-人类界面的传播对于保护世界人们免受动物流行病和大流行病的影响非常重要。通过疫苗接种对动物疾病进行预防是针对传染病最具成本效益的干预策略之一，是防止各种疾病传播的最有效、最经济的手段。大多数疾病的治疗和预防都有可用的疫苗。

兽用疫苗（Animal vaccines）是利用微生物及其代谢产物、结构物质或是受感染的动物血液、体液、组织等，经不同的工艺程序制备成，通过刺激动物免疫系统产生免疫物质，从而预防和治疗特定疾病的生物制品。

根据疫苗制备程序以及疫苗研发的进度，本文将兽用疫苗分为常规疫苗、基因工程疫苗、尚在研究中的疫苗三大类。

1 常规疫苗

1.1 弱毒疫苗

弱毒疫苗是通过物理、化学或生物连续传代的方法将天然强毒株转化为弱毒株，从而降低其对宿主动物的致病性，但仍保持良好的免疫原性，并将这类弱毒株制备而成得疫苗[4]。这类疫苗通过在宿主体内复制，更准确的模拟自然感染，刺激机体免疫系统产生更长久的免疫力。但这类疫苗存在稳定性差、毒力强、毒株变异等缺点。

1.2 灭活疫苗

灭活疫苗是将标准强毒株或保有免疫原性的弱毒株经大量培养后，将其经特殊的灭活处理后制备而成的疫苗。灭活苗需要通过添加佐剂提高其免疫能力，根据所添加的佐剂不同，灭活疫苗可分为油佐剂疫苗，铝胶佐剂疫苗，蜂胶佐剂疫苗[5]。灭活疫苗具有安全性好、易保存、无污染、无危险、易于制备联合疫苗或多价疫苗等优点，但其生产成本高、免疫期较短、免疫途径单一，需进行多次免疫接种来诱导体液免疫。

1.3 类毒素疫苗

类毒素疫苗是用甲醛对病原体产生的外毒素进行解毒，使其失去致病性，但仍保留其免疫原性而制成的生物制品。肌肉注射类毒素疫苗后，可诱导机体免疫器官产生免疫，产生相应的抗毒素，进而获得主动免疫。

2 基因工程疫苗

2.1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是对微生物进行物理和化学处理，去除其无效物质，提取其如细菌荚膜、鞭毛、病毒衣壳蛋白等有效抗原制备的疫苗。具有副作用小、免疫效果好、应用潜力大等特点[6]。外源基因可以被插入到表达载体中，作为这些基因编码的外源蛋白的生产工厂，这为疫苗接种研究提供了一种相对取之不尽、用之不竭的廉价蛋白质来源，根据表达系统可分为以下5种。

2.1.1 细菌表达 首次利用大肠杆菌建立了重组表达系统，这种表达系统可以提供相对大量的定义蛋白，因此许多亚单位疫苗选择大肠杆菌表达系统。但是原核细胞具有不同的加工和运输机制，表达的蛋白质经常被错误地折叠。此外，许多候选疫苗蛋白中存在的信号序列、糖基化位点和二硫键可能会导致细菌内的毒性、不溶性或快速降解。

2.1.2 酵母表达 酿酒酵母作为一种工业微生物的广泛使用，使其成为替代抗原蛋白表达系统的自然选择。与原核系统相比，它还有一个额外的优势，即蛋白质的翻译后修饰以类似于高等真核细胞使用的方式进行，因此，重组蛋白质更有可能被正确折叠。酵母表达的蛋白质会被糖基化，尽管这种糖基化将不同于哺乳动物细胞进行的糖基化[7]。

2.1.3 昆虫细胞表达 利用杆状病毒载体—银纹夜蛾核型多角体病毒感染果蝇的昆虫卵巢细胞，开发了一种新颖的表达系统。这些病毒拥有一个强大的启动子，控制着一种 29 kDa多面体蛋白的产生，这种多面体蛋白最终积累到感染细胞总蛋白的50 %。用选定的外源基因替换可以产生高水平的重组蛋白，这些重组蛋白质也将进行翻译后修饰，包括糖基化、磷酸化和信号肽切割[8]。

2.1.4 哺乳动物细胞表达 由于许多病原体会在培养的哺乳动物细胞中感染和复制，亚单位疫苗的抗原蛋白是哺乳动物表达系统的自然选择。不过现阶段存在的技术难题是哺乳动物表达水平可能比使用上述替代表达系统获得的表达水平要低一些。

2.1.5 植物细胞表达 植物细胞是新兴的表达系统，虽然过去植物遗传学家主要集中在作物改良上，但最近的一些研究表明，植物可能为哺乳动物蛋白质提供一个有用的表达系统。为了在植物中表达外源基因，必须将植物启动子、终止子和调控序列拼接到克隆的互补 DNA上。还可以加入可选择的标记以便于重组体的鉴定，并且表达宿主可以是植物或者是细胞培养物。使用这种表达系统的第一种获得许可的疫苗是针对家禽中的新城疫病毒（NDV）感染[9]。

2.2 活载体疫苗

活载体疫苗是经过基因工程改造后的一种重组疫苗，使用活载体递送亚单位或多肽疫苗的方法，免疫动物后在体内产生保护性抗原，进而刺激机体免疫系统产生保护作用。活载体疫苗的免疫诱导过程与自然过程相似，所以免疫效果更好。根据载体可分为以下3种。

2.2.1 病毒载体 这类疫苗是指以病毒为载体，表达保护性抗原基因的疫苗。腺病毒、痘病毒、疱疹病毒等都可用作病毒载体。病毒载体可通过多种途径刺激免疫系统，可较好地诱导体液免疫和细胞免疫，有利于产生免疫保护效果。这类疫苗的有效性和稳定性较为重要，可通过提高抗原特异性、添加或优化启动子等元件、共表达分子佐剂来提高免疫保护效果[10]。

2.2.2 细菌载体 细菌活载体疫苗是一种新型疫苗，在过去十多年间发展快速，免疫后在机体内能大量表达外源基因，从而刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。细菌活载体疫苗的载体主要包括乳酸菌、卡介苗、沙门氏菌、大肠埃希菌等[11]。

2.2.3 原生动物载体 一种非常新颖的载体技术是使用一种活的原生动物寄生虫（艾美耳球虫），这种寄生虫已经经过基因改造，可以将同源或异种抗原输送到家禽。这种疫苗将使用目前获得许可的商业减毒株且已经被开发出来，外源基因将利用酶介导的整合方式在减毒载体中表达。然后可以提供转基因菌株，以提供对致病菌感染的更广泛保护。

2.3 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是通过基因层面的操作，去除细菌或病毒中与致病性相关的基因序列，使其成为无毒株或减毒株，但仍保持免疫原性。经典减毒方法制备的疫苗虽然毒力下降，但免疫原性发生明显变化，或者在应用过程中容易发生逆转，从而存在发生潜在传播病原的风险。而基因缺失疫苗因基因缺失突变机率低，基因缺失疫苗在保护其免疫原性基因方面相对更安全，应用前景更加广泛[12]。

2.4 合成肽疫苗

合成肽疫苗又称表位疫苗，通过识别和测序感染源上的重要免疫原部位，在许多情况下可以使用氨基酸（多肽）的短链来模拟这些部位。因合成肽疫苗不含病原微生物的基因组，故不会与宿主基因出现重组现象，相对安全[13]。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗又称 DNA疫苗，将抗原编码基因连接到空质粒上，然后将构建的重组质粒直接注射到动物体内激活免疫系统，合成内源性蛋白模拟自然感染。核酸疫苗免疫动物后表达保护性抗原，刺激机体产生免疫反应，从而产生长久的保护作用。其合成的抗原蛋白类似于亚单位疫苗，不同的是核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫主体中产生的，抗原以其天然形式存在，并将引发MHC I类和II类T细胞反应以及抗体反应，没有感染的风险[14]。

3 展望

目前仍处于实验室研究阶段的兽用疫苗有转基因植物可食用疫苗和抗独特型疫苗。转基因植物食用疫苗是将编码微生物抗原的基因导入植物细胞，当生物摄入含有这种抗原的转基因植物后，就会对相应的微生物产生免疫力，进而达到免疫预防目的一类疫苗；抗独特型疫苗通过模拟抗原刺激机体，使机体产生与模拟抗原产生的相应特异性抗体作用相同的抗体，从而抵抗病原体的感染[15]。

理想的疫苗应该具有效果好、安全稳定、易于接种、成本低、适用范围广、与其他疫苗联合应用等特点。灭活疫苗和减毒活疫苗在畜牧业上发挥了巨大的作用。随着不断发展，传统的兽用疫苗弊端不断暴露，灭活疫苗对特定病原体达不到理想的作用，减毒活疫苗可能诱发毒力返强，从而引起病原大面积传播。在当前传统疫苗发展明显受限的情况下利用分子生物学手段研发新型疫苗显得尤为重要[16]。