肾纤维化手术动物模型构建及相关机制研究进展*

刘 洋 张瑞红 只素娟 刘兰兰 刘旭玥 冯晓宁 张晓丽

（山东大学齐鲁医学院基础医学院人体解剖学与组织学胚胎学教研室，济南 250012）

慢性肾脏疾病在中国较常见的是IgA肾病[1]，其次为糖尿病肾病、高血压肾病及其他，它们的终末阶段主要表现为肾纤维化[2-4]。肾纤维化的病理改变主要为肾小球硬化，肾间质中大量胶原纤维形成等[5]。目前，我国患有慢性肾病的人数逐年增加[6]，临床上治疗慢性肾病发展为肾纤维化过程方面仍然十分困难[7]。在研究肾纤维化发生机制中，由于临床标本难以获得，因此建立动物模型可以更方便地进行相关实验研究。目前常用的构建模型的方法包括手术建模、药物或毒物诱导模型、复合模型和转基因模型，其中，药物或毒物建模的剂量和时间不易控制，复合模型过程比较繁琐，转基因模型花费高昂且其应用范围较窄，而手术建模的方法简便、快捷、应用广，而且能更好地模拟人类肾纤维化的进程[8]。因此，本文主要对肾纤维化手术建模方法以及机制研究进行总结。

1 肾纤维化手术建模类型

肾纤维化手术建模主要包括3种类型：肾组织大部切除术、缺血再灌注损伤和单侧输尿管结扎。肾组织大部切除术建模的原理主要是通过将肾组织大部切除后，肾单位数量大大减少，而流经肾的血流量变化不大，使残余肾组织承压增加，各种与炎症反应相关的炎症细胞大量浸润，比如巨噬细胞，其可促进转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等促纤维化细胞因子释放，然后通过上皮-间充质转化，促使肌成纤维细胞不断分泌胶原纤维，胶原纤维的大量沉积可引起肾纤维化发生[8]。缺血再灌注损伤模型诱导的肾纤维化建模的原理主要是因为缺血组织在没有恢复正常的代谢功能时，由于再次恢复血运而加剧对肾小球和肾小管等的组织损伤，在后期也可导致肾组织发生纤维化[9]。单侧输尿管梗阻手术建模的原理主要是输尿管梗阻导致尿液不能正常排出而积聚于肾，从而导致肾肿大，肾小球滤过率减少，最后引起肾小管的快速萎缩、坏死和间质中大量基质堆积[10]。

1.1 肾组织大部切除术肾纤维化模型

制备方法：准备6～8周雄性大鼠，随机分为假手术组和模型组，麻醉大鼠，手术操作台固定，去除腹部毛发且暴露区域足够大，75%乙醇对腹部区域进行消毒。模型组在距左脊肋角1～2 cm处斜向外方切一小口以暴露左肾，游离肾周围脂肪组织，丝线结扎上、下极肾组织约1/3，1周后再次手术将整个右肾切除，2次手术一共切除5/6肾组织；假手术组大鼠只需划一切口，不需切除肾组织。模型构建过程中，手术操作要求比较高，操作者应熟练整个手术流程。同时，肾是一个易出血的脏器，应重点做好止血准备。在建立模型后的2、4、8、12周分别取肾组织，通过H-E染色（hematoxylin-eosin staining ）、Masson三色染色（Massontrichrome staining）、PAS染色（periodic acid-schiff staining）及免疫组织化学方法观察肾组织结构改变，主要观察肾小球是否有局灶或全部硬化，肾小管是否有萎缩或扩张以及肾间质纤维化的程度等[8-11]。

模型特点：该模型手术过程不算复杂，且可行性大，成功率也高。但是，手术存在出血、感染的可能，手术操作过程应注重止血、无菌操作。

模型应用：主要用于研究肾小球硬化导致的肾纤维化。Wen等[12]利用该模型，研究了青蒿素可通过NF-κB/NLRP3途径减轻大鼠肾纤维化。另外，Zhu等[13]利用肾切除模型验证了中药（益气化瘀通络方）可通过影响Nrf2/Keap1信号通路，下调TGF-β1蛋白表达，从而减少残余肾氧化应激损伤及纤维化程度。

1.2 缺血再灌注损伤肾纤维化模型

制备方法：准备6～8周雄性大鼠，随机分为假手术组和模型组，麻醉大鼠后操作台固定，剔除腹部毛发，并用75%乙醇进行消毒。打开腹腔后将双侧肾动脉钳夹45 min，然后取下钳夹进行再灌注24 h后，取血清和肾组织分别进行研究。操作时，严格把握钳夹动脉血管的时间以及灌注时间，此步是该模型成功的关键。有研究证明，对照组血清乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和肾功能相关标记物如血清尿素氮（b1ood urea nitrogen，BUN）和肌酐显著增加[14]；通过H-E染色、Masson三色染色和PAS染色，可以观察肾组织结构变化和纤维组织含量变化（如是否有肾小球局灶或全部硬化、肾小管萎缩或扩张以及肾间质纤维是否增加）[8]；通过免疫组织化学显色可以观察与肾纤维化相关标记物的表达情况，如α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和TGF-β1等的含量改变[15-16]。

模型特点：该模型建模耗费时间相对较短，操作方法最简单，肾纤维化特征比较明显。但是，该模型的缺血时间不易控制，缺血时间短暂，其造成的损伤是可逆的，缺血时间较长的话，其损伤是不可逆的。

模型应用：应用较广，大多数用于研究肾小球硬化。Zhou等[17]通过构建缺血再灌注损伤肾纤维化模型验证了CB2/β-catenin通路可促进肾纤维化，靶向抑制CB2或β-阻滞素1可抑制纤维化的进展。Qi等[18]发现C5a/C5aR1轴可促进小鼠肾缺血再灌注损伤后肾纤维化的进展。

1.3 单侧输尿管梗阻肾纤维化模型

制备方法：准备6～8周雄性大鼠，腹腔注射麻醉剂后，将其固定于操作台上，用剃毛器去除腹部毛发，喷洒75%乙醇对腹部区域进行消毒，在左侧腹部行一切口，充分暴露输尿管，并游离周围脂肪组织，切除左侧输尿管，并缝合结扎伤口；假手术组大鼠仅打开腹腔暴露输尿管，并游离周围脂肪组织，但不处理输尿管，分别于手术后3 d、7 d和14 d取肾组织，通过H-E染色等观察肾组织结构的改变[19-20]。手术操作时，应注意严格执行无菌操作，保护好肾周围组织，同时需要将肾放于原位，并逐层缝合。肾小管间质损伤评分主要根据肾小管上皮细胞是否有空泡变性、坏死以及变性、坏死的比例；肾小管是否有扩张或萎缩；间质纤维化病变程度；通过尿常规检测尿中有无红细胞管型和蛋白管型等；肾间质相对面积测定主要是通过Masson染色法之后，计算胶原纤维蓝染面积占整个肾间质面积百分比；肾小管间质α-SMA含量主要是通过图像分析，计算棕黄色染色面积占整个肾间质面积的百分比[21]。

模型特点：该模型操作步骤简单，同时建模时间短，可多次重复建模且病变一致，成功率较高。该模型的缺点是，此模型不适用于研究肾小球硬化，并且在建模前期，需要多次摸索导致肾纤维化特征较明显的时间点。

模型应用：主要适用于研究肾间质纤维化。 Zhao等[22]通过构建单侧输尿管梗阻肾纤维化模型，验证了L-肉碱可预防单侧输尿管梗阻模型中小管间质炎症和纤维化。另外，还有一些研究表明姜黄素[23]、雷公藤[24]等药物可用于减轻单侧输尿管梗阻引起的肾纤维化。

2 肾纤维化的发病机制

当肾组织受损时，可促进以巨噬细胞为代表的炎症细胞浸润，进而这些炎症细胞释放各种与纤维化相关的细胞生长因子，导致间质中大量胶原纤维沉积，使肾结构受损、功能减弱，是肾纤维化形成中的重要分子机制。目前对于肾纤维化发生机制的研究主要集中于以下几条经典的信号通路，通过对参与肾纤维化的信号通路的研究，可以发现新的分子靶点，为临床肾纤维化的诊断与治疗提供实验基础。

2.1 TGF-β1/Smad通路在肾纤维化发生中的作用

TGF-β1是驱动肾纤维化的重要因素，可直接激活Smad信号转导，引起下游与纤维化相关靶基因的过度表达。研究证实，TGF-β1/Smad通路的失调在肾纤维化发生中起重要作用[25]。

TGF-β是生长因子超家族的一部分，在哺乳动物中已经鉴定出 3 种，其中对TGF-β1的研究最多。TGF-β1 及其2 种 TGF-β 受体 （TGF-β receptor，TGFβ-R）Ⅰ和Ⅱ在上皮间充质转化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）和纤维化中起关键作用[25]。在肾纤维化发展进程中，TGF-β1与其受体结合可以诱导Smad3发生磷酸化，从而触发其下游与纤维形成紧密相关的基因如α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白（collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）、纤连接蛋白（fibronectin，FN）等的表达，使胶原纤维在肾脏组织中大量沉积[26-27]。

2.2 Wnt/β-catenin信号通路在肾纤维化发生中的作用

Wnt/β-catenin信号通路在进化上高度保守、复杂而关键，参与调控细胞命运、组织稳态、器官发育、损伤和修复。它在正常成人肾中相对沉默，但在肾脏疾病患者和建立的肾纤维化的动物模型中，由于肾组织受到损伤，该信号通路被重新激活[28]，长时间和过量的信号通路激活可导致肾纤维化[29]。，Wnt/β-catenin信号通路的激活在慢性梗阻性肾病和肾间质纤维化所致肾损伤的发病机制中发挥重要作用[30]。

Wnt家族中至少有19个Wnt家族成员对肾的发育至关重要，其缺失可导致各种肾脏疾病的发生[31]。Wnt蛋白可通过与Frizzed（Fzd）受体家族及其共受体LRP5/6相互作用，通过细胞膜传递信号，激活Disheveled（Dsh/DVL），进而将信号传递给β-连环蛋白（β-catenin）[31]，β-catenin在细胞核中募集后，与T细胞特定的转录因子（TCF）或淋巴增强因子（LEF）结合，调控Wnt下游基因的表达[32]。Wnt/β-catenin信号通路主要通过诱导其靶基因的表达而发挥生物学活性。近年来，大量与肾纤维化相关的靶基因包括FN、Snail1、基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、成纤维细胞特异性蛋白1及RAS等组分相继被发现[31-32]，并发现了几种Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，包括可溶性Frizzed相关蛋白（SFRPs） 、Wnt抑制因子、Dickkopf（DKK）家族和抗衰老蛋白Klotho等。SFRPs与Frizzed序列具有同源性，可以在细胞外空间与Wnts结合和隔离，进而阻止其与Fzd受体结合；Wnt抑制因子和Klotho可与Wnt蛋白结合，并阻止其信号传递；DKK家族蛋白通过与LRP5/6共受体结合和内化来拮抗Wnt/β-catenin信号通路的激活[28，33]。

2.3 Notch信号通路在肾纤维化发生中的作用

Notch 信号通路的主要功能是调节细胞间的相互作用[34]。该通路主要由Notch配体、 Notch 受体以及Notch 的调节分子等组成。Notch配体包括Jagged 1（Jg1）、Jagged 2（Jg2）、Delta样1（Dll1）、Delta样3（Dll3）或Delta样4（Dll4）。Notch 受体由 Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4组成[35]。这些受体在接受信号细胞的质膜上，经过糖基化、糖醛样转换酶和亚当金属蛋白酶受体的第二次切割，配体与受体结合后再启动第3次切割，然后Notch 受体胞内的结构域被转移到细胞核，与转录调节因子如Rbpj和Maml结合，促使相关基因的表达[36-38]。相关文献证实，肾受损可引起Notch信号活性及Notch 受体表达增加，导致上皮脱分化、肌成纤维细胞活化和基质沉积等[36]，从而引起肾纤维化改变。

在新生儿及成人阶段Notch信号通路通常是被抑制的，如果发生肾损伤，该通路则被重新激活[29]。相关研究证实，Notch信号通路的异常激活与肾纤维化的发生密切相关[35]。

2.4 Hedgehog（Hh）信号通路在肾纤维化发生中的作用

Hh信号通路比较复杂，它参与胚胎发育过程中多方面的调节，在组织内平衡中起着决定性作用，当肾组织受损时，Hh信号通路被异常和持续地激活[39]。其激活主要直接靶向作用于肾纤维化发生的中心事件——肌成纤维细胞（大部分来源于肾间充质干细胞样细胞）的活化、增殖与转化，提示该通路的激活与纤维化发生密切相关[40-41]。

Hh信号通路主要由Hh配体、Patched受体（Ptch受体）、共受体（Cdon/Ihog，Boc/Boi，Gas1）、换能器Smooth（Smo）及下游转录因子Gli组成，该通路分为经典模式和非经典模式通路[40]。在经典模式通路中，当肾组织受损时，Hh信号增加，Hh在共受体辅助下与Ptch结合后下调Ptch的膜表达，从而使Smo在膜表面富集，Smo进行信号转导使Gli与其抑制蛋白su fu及Cos2分离，从而开始活化与核转位，最终激活靶基因，如Gli1、Ptch1、N-myc及细胞周期蛋白D/E等[39-40]。非经典通路的特点是与配体无关的Ptch激活或Smo激活，通过TGF-β、Wnt等多信号的调节直接激活Gli使其转录。相关研究证实，Gli1可增加肌成纤维细胞的活性使其大量增殖，可还诱导EMT关键因子Snail1以及Twist1上调，上皮细胞发生EMT转化，间质中胶原纤维过度沉积引起肾脏纤维化的发生[39-42]。

尽管慢性肾脏疾病的发展过程比较缓慢，但最终都可引起肾纤维化的发生。在肾纤维化发生过程中，胶原纤维大量沉积，肾结构发生改变，可导致肾功能严重缺失。肾纤维化过程是否可以逆转，取决于参与肾纤维化发生、发展过程的各种因素，因此研究其发生机制尤为重要。本综述总结了几种常见的通过外科手术建立肾纤维化动物模型的方法，以及参与肾纤维化发生、发展过程的几条经典的信号通路，以期为关注肾纤维化的研究者提供一些参考。通常情况下，如果研究者主要关注肾小球硬化型的肾纤维化，一般选用通过肾大部切除术或者肾缺血再灌注来建立肾纤维化的动物模型；如果研究者主要研究肾间质纤维化，一般建议通过单侧输尿管梗阻建立肾纤维化的动物模型。目前，临床上对于肾纤维化的患者仍缺乏效果良好的治疗方法，通过肾纤维化的动物模型以研究肾纤维化的发生机制可以有助于该疾病相关新药研发和更有效精准的治疗。医学研究人员通过建立各种肾纤维化的动物模型来研究肾纤维化的发生和发展机制，寻找参与肾纤维化的信号通路；药物研发人员以这些信号通路中的分子为靶点，研发相应信号分子的激动剂或抑制剂，开发可能应用于治疗人类肾脏纤维化的药物，减轻或防止肾脏纤维化的发生。