透射电镜样品制备及观察在本科实验教学中的应用*

张晓丽 王立言 郝 晶 侯桂华 张玉华 张向红△

（山东大学基础医学院，1 组织学与胚胎学教研室，2 实验核医学与电镜中心，3 信息化教学研究中心，济南 250012）

在现代医学领域，电镜技术在临床诊断、医学研究方面的应用越来越广泛，许多医学院校都开设了电镜课程。如何在有限的时间内使学生有兴趣主动学习，并获得最好的效果，是值得探讨的问题[1]。笔者所在电镜实验室自20世纪80年代开始面向医学相关专业本科生开设选修课，授课教师在长期的实践教学工作中积累了丰富的经验，总结如下。

1 明确实验教学目标

目前，电镜教学尚无统一的教材和教学大纲，各高校对学生的培养目标也没有统一标准[2]。根据多年工作的经验，山东大学基础医学院电镜实验室首先确立了本课程的培养目标，具体包括：了解电镜技术在科研及临床中的应用；培养学生严格、细致的科研作风，提高学生的动手操作能力[3]；教会学生认识常见的正常和病理超微结构。总之，通过实验教学，可以使学生对电镜技术的发展现状、样品制备原理及方法有一定了解，使其在今后的学习和工作中用到电镜时，能够顺利阅读并理解相关文献，根据研究目的选择合适的样品制备方法，正确分析电镜相关的实验结果。

2 加强实验教学内容建设

电镜实验教学内容丰富、专业性强、操作复杂、技术要求高。以往电镜样品制备过程的教学，通常由教师讲解和示范，学生缺少动手机会。通过多年的教学实践，现在本实验室进行的实验教学可以满足学生独立完成取材至包埋的过程，其他由教师演示，学生参观、提问和教师答疑来完成。为了提高学生学习电镜的兴趣、增加学生动手操作的机会，对以下教学内容进行了调整。

2.1 优化包埋步骤，重点突出样品取材

取材是样品制备的第一步，取材失误将导致后续工作无法进行。因此要求学生在实验教学过程中重点掌握动物器官、组织和游离细胞的取材。针对容易出现的问题，和学生一起分析原因，找出解决办法。如取材组织块太大，固定液和包埋剂不能渗透到组织内部，导致结构保存不良和切片困难的问题。共同分析可能由于新鲜组织柔软，难以切割为形态规则的小组织块；解决方法是可以先剪取较大的组织块，放入固定液内，硬化几分钟，此时再将组织块切成 1 mm3的小块，注意只切取表面固定好的组织。再比如学生遇到取材部位不准确或切片方向不明确导致看不到想要的结构时，教师可以引导学生对组织或器官进行平面和立体的解析，进一步了解组织或器官各部分的结构，进而根据研究目的选取适当的位置，像胃肠道、皮肤、角膜、视网膜、耳蜗、肌肉等在取材时要注意方向性，并且在取材时需做出标记，或修整为与切面垂直的长方体形状。对于培养细胞来说，不同阶段的培养细胞结构差异较大，更需掌握适当的取材时机，同时还要注意选择合适的离心速度和离心时间，既要避免细胞团块太松散，又要防止结构遭到破坏。

2.2 对样品制备环节进行有序剪辑及分割

将以往演示甚至省略的样品制备环节进行有序剪辑和分割，例如将整个样品制备过程分解成载网的选择与清洗，支持膜的选择与制备，刀的选择与玻璃刀的制备，包埋块修整等几个实验项目。不同的样品要选择不同的载网和切片刀；利用酸碱法清洗载网；利用漂浮法制备Formvar膜，通过膜的颜色判断其厚度及一致性；采用平衡断裂法制备45°的玻璃刀，了解断裂成刀时越接近“角对角”断裂，刀刃越锋利，切片时的挤压变形越小；断裂越慢，刀刃的可用区域越长；在超薄切片机上手工修整包埋块，暴露出样品并将顶面修成一定的形状。这些内容由学生亲自动手操作，提高了学生对电镜实验教学的兴趣，增强了学生的实践操作能力。

2.3 增加即时可获得结果的实验项目

利用超薄切片机制备0.5～2.0 µm厚度的半薄切片，甲苯胺蓝染色3～5 min后即可用光镜观察。由于结构保存良好，且比石蜡切片薄很多，半薄切片能观察到更细微结构，不仅可用于定位及对同一部位进行光镜和电镜的对比观察，还能用于肌肉、肾、肿瘤等疾病的诊断。另外负染色样品制作简单，在细菌、病毒和寄生虫的诊断及噬菌体、孢子、核酸、蛋白质晶体等大分子材料的研究分析方面有显著的成效。指导学生直接对沉降的颗粒悬液样品进行负染色，干燥后快速进行电镜观察。在实验教学中增加的这些内容可以使学生更充分了解电镜技术在科研和临床中的实际应用。

2.4 强化超薄切片及电子染色内容

超薄切片是样品制备的关键。了解超薄切片机的结构及工作原理，其操作可在对刀之后由学生亲自动手，调节进刀尺度和切片速度，观察切片过程。了解切片厚度的判断方法及影响因素，指导学生用3种方式捞取超薄切片，介绍各自优缺点。了解电子染色的原理及常用染色剂的特点，指导学生利用手工和自动染色机进行染色。了解切片缺陷及染色污染产生的原因，有些可以凭借操作者的经验予以排除，有些无法弥补导致实验失败。样品制备每一步都必须严格、精细，以此培养学生严谨、细致的工作作风。

2.5 重视电镜调整与结构分析

电镜图像的质量不仅取决于样品制备，还与整个仪器的状态密切相关。确保足够的灯丝亮度；选择合适的加速电压；调节聚光镜光阑、物镜消像散，对电子束进行校正合轴；学习欠焦、正焦、过焦3种状态的调整；正确地进行电镜操作，才能拍摄出高质量的透射电镜照片。指导学生在电镜下进行结构观察，认识细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网等正常细胞结构，了解组织和细胞病变时常见的超微结构改变，并与机能和代谢的变化相联系，为学生以后阅读理解相关文献、正确分析电镜实验结果打好基础。

3 开展综合创新实验课程

2017年开始，电镜实验室与同位素研究中心及分子生物教学平台联合开展“细胞学纵向综合创新实验课程”，全方位覆盖细胞学研究的常规技术和方法，包括细胞培养、增殖状态观察、分泌因子测定、移植瘤小鼠模型制备、细胞及肿瘤的石蜡和超薄切片制备、结构观察等内容。通过近4年的实践，学生选课积极，课堂气氛活跃，能主动联系所学理论知识，对“细胞-肿瘤”这一主题提出问题并展开讨论，使学生了解电镜技术与其他学科的联系及在解决实际问题中的应用，开拓了视野，培养了发现问题和解决问题的科研实践能力。

4 改变实验教学形式

集中授课时，将学生进行适当分组，进行小班化教学，教师可以更具体地指导每名学生操作；集中授课时间之外，对学生开放实验室。学生可以自主预约进入实验室的时间；允许学生自带实验材料参与实验室技术服务工作，同时将服务中经常遇到的问题介绍给学生，使学生尽早接触到科研和临床实践；同时将常用的电镜技术整理汇编成技术手册，由熟练的技术人员操作，并录制成实验教学视频，且通过网络实现资源共享，为学生创造自主学习的良好环境[4]。

5 注重学生反馈

电镜实验教学内容繁杂，实验报告很容易写成流水账。目前，鼓励学生在实验课后，提出对该课程的意见和建议，学生都会比较积极地参与其中，这些意见和建议对改进实验教学具有非常重要的意义。指导教师对学生的建议基本能做到件件有回应。例如，有学生建议建立微信群，以便对课程相关问题随时进行讨论。经充分讨论，指导教师不仅建立了微信群，同时还申请了公共邮箱，更加方便指导教师和学生之间的即时交流。还有学生建议按常规标准流程制备样本，并进行结构观察。指导教师鼓励这部分学生自主预约时间，参与实验室的开放教学。这些措施提高了学生的学习兴趣，使学生的学习热情高涨。

综上所述，大型仪器用于教学，存在着教学内容匮乏的难点。大型仪器应用于教学的目的不应仅局限于学会仪器的开、关及参数选择，更应该着重于实际应用和拓展，在仪器原理和操作的学习过程中培养学生的动手能力、思考能力和创新实践能力[5]。近年来，山东大学基础医学院电镜室注重加强教学内容建设，将实验教学与技术服务相结合，着重开发可用于面向学生开放的教学项目，改进实验教学形式，提高学生对电镜技术的兴趣和动手操作能力。这些措施既提高了实验教学的质量，又促进了技术服务的开展。目前，技术服务送样合格率明显提高，来咨询的师生对电镜技术大多都有了一定的了解。这些改变又进一步激发了实验人员的工作热情。今后，电镜室将根据学生自身的学习能力以及对自我要求的不同，开设不同层次的实验教学课程[6]，充分发挥电镜在实验教学中的作用，保证实验教学开放的长期性、稳定性和持续性。