中性粒细胞外诱捕网在肿瘤微环境中的作用研究进展

马雪妮，许慧梅，张德奎

兰州大学第二医院消化内科，兰州 730030

肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)是肿瘤生长所必需的微环境[1]，包括细胞成分与非细胞成分。细胞成分包括间充质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞、周细胞及脂肪细胞等，非细胞成分包括细胞外基质、基质金属蛋白酶(MMPs)、细胞因子及趋化因子等。其中免疫细胞、间充质细胞及内皮细胞可分泌多种细胞因子直接作用于肿瘤细胞，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，它们相互调控，共同形成抑制性免疫分子网络，使肿瘤细胞能够躲避机体免疫系统的攻击，实现免疫逃逸[2-3]。

中性粒细胞是人外周血中最丰富的白细胞，约占白细胞总数的50%～70%，在先天性免疫系统中扮演着重要角色[4]，可通过吞噬作用、脱颗粒、产生活性氧等多种途径抵御外界病原体的入侵，是机体应对病原体入侵的第一道防线[5]。除此以外，中性粒细胞还可形成有别于细胞坏死及凋亡的特殊细胞死亡程序——中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，参与机体的各种病理生理过程[6]。

近年来研究发现，中性粒细胞产生及释放NETs的过程不仅发生在败血症等感染性疾病中，而且在非感染性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、糖尿病、动脉粥样硬化、急性肺损伤、肝缺血再灌注损伤、血栓形成及慢性肝病中也发挥着关键作用[7-8]。此外，NETs在多种肿瘤中高表达，如肺癌[9-11]、肝癌[11]、淋巴瘤[12]、结直肠癌[13]、乳腺癌[10,14]、胃癌[15]等，并与肿瘤的发生、发展、转移及其相关的血栓形成密切相关。本文就TME对NETs表达的影响，以及NETs在TME中的作用进行综述，旨在探讨NETs作为肿瘤标志物及潜在治疗靶点的临床应用前景。

1 TME对NETs形成的影响

1996年，Takei等[6]在使用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激中性粒细胞时，观察到一种不同于细胞凋亡(核固缩、细胞质空泡化)及细胞坏死(保持核膜完整性)的现象，即中性粒细胞的分叶核退缩、扩散，继而核膜破裂，核内成分释放到细胞质，细胞膜破裂[6]。直到2004年，Brinkmann等[16]将该过程中释放到胞外的纤维网状结构正式命名为NETs。NETs是以DNA为骨架并镶嵌多种活性蛋白的细胞外网状结构，其中的活性蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及组织蛋白酶G(cathepsin G，CG)等，而染色质是网状结构的主干[17]。研究发现，多种物质均可刺激中性粒细胞产生NETs，包括细菌、真菌、原生动物、病毒等在内的病原体以及一些化学或生物因素[5,9-13]。

白细胞介素(IL)-8是CXC家族的典型趋化因子，又称CX-CL8，负责中性粒细胞向炎症部位的募集并活化[18]。研究发现，来自弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)的IL-8与中性粒细胞上的受体(CXCR2)相互作用，通过激活Src、p38及ERK信号通路形成NETs[12]。同时，Alfaro等[19]发现，在前列腺癌及非小细胞肺癌中，肿瘤细胞产生的包括IL-8在内的趋化因子能够募集骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，使其形成NETs，该过程能够募集更多的中性粒细胞，有助于肿瘤细胞的免疫逃避。最近有研究显示，黑色素瘤及胰腺癌中的肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)产生的淀粉样蛋白β能够刺激NETs的形成，称为肿瘤相关NETs(t-NETs)，此过程依赖于活性氧(ROS)的产生[20]。因此，TME能够刺激NETs的产生，从而促进NETs形成(NETosis)。

2 NETs对TME的影响

2.1 对肿瘤细胞的影响 NETs能够促进肿瘤细胞的增殖。Miller-Ocuin等[21]研究发现，来源于NETs的细胞外DNA可通过激活胰腺星状细胞促进肿瘤细胞增殖，而通过肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)抑制剂或脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)抑制NETs的生成能够逆转上述作用；且这种促肿瘤细胞增殖的机制还可能涉及NETs的多种活性蛋白酶。Yazdani等[22]研究发现，结直肠癌细胞受到外界刺激后会释放损伤相关分子模式(DAMP)蛋白，在此过程中将中性粒细胞募集到TME，并诱导NETs的形成，而NETs主要通过增加线粒体的生物合成来增加能量的产生，并促进肿瘤细胞的增殖。NETs通过释放NE激活TLR4-p38-PGC-1α轴，从而促进线粒体生物合成及肿瘤生长。在PAD4-/-小鼠体内，通过DNase Ⅰ或NE抑制剂(NEi)抑制NETs的形成，或在体外阻断NE-TLR4-PGC-1α轴，都可以抑制线粒体的生物合成并减缓肿瘤的生长。此外，DLBCL产生的NETs可直接上调DLBCL Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)途径，随后激活核因子(NF)-кB、STAT3及p38途径，从而促进肿瘤进展。动物实验研究发现，抑制NETs形成、阻断IL8-CXCR2轴或抑制TLR9均会抑制肿瘤的进展[12]。

NETs可促进肿瘤细胞的转移。Martins-Cardoso等[14]发现，NETs能够将人乳腺癌细胞MCF7(主要为CD44Lo/–CD24+表型)转化为CD44+CD24Lo/–表型，而CD44是一种细胞表面糖蛋白受体，可识别多种配体，包括细胞外基质成分如透明质酸、骨桥蛋白、金属蛋白酶等，与肿瘤迁移及转移有关[23]。将NETs与人乳腺癌细胞MCF7共培养发现，NETs能将MCF7典型的上皮形态转变为间充质表型，即N-钙黏蛋白及纤连蛋白的表达增加，而E-钙黏蛋白的表达被抑制，从而导致MCF7细胞的迁移能力增强。还有研究证实，在小鼠结肠癌及肺癌模型中，即便不存在败血症，NETs仍可捕获循环中的肿瘤细胞，使其黏附于肝脏[24]。而Najmeh等[25]研究发现，在肺腺癌细胞中，这种黏附作用是整合素介导的蛋白-蛋白互相作用；在NETs及肿瘤细胞中，β1整合素均呈高表达，且两种β1整合素均参与了这种黏附作用；而将NETs上的β1整合素阻断后，肿瘤细胞与NETs黏附减少，当肿瘤来源的β1整合素被抑制后，来源于NETs的β1整合素也会相应减少，由此可以推论来源于NETs与来源于肿瘤细胞的β1整合素可能存在某种共域化作用。此外，跨膜蛋白CCDC25是一种存在于肿瘤细胞表面的NETs DNA受体，可通过激活ILK-β-parvin信号通路增强肿瘤细胞的活性，从而促进肿瘤的转移[26]。

2.2 对免疫细胞的影响 TME中浸润的免疫抑制性细胞是肿瘤抑制性免疫微环境形成的关键因素，这些免疫抑制性细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)、MDSCs、调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)等，它们能够协助肿瘤进行免疫逃逸，促进肿瘤的发生发展[27]。研究发现，肿瘤细胞产生的趋化因子可促进中性粒细胞及MDSCs发生NETosis，在此过程中，NETs将肿瘤细胞包裹起来，阻断了免疫细胞与周围靶细胞的结合，从而使肿瘤细胞免受CD8+T细胞及自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性作用，而PAD4抑制剂可抑制肿瘤的转移，是肿瘤免疫治疗的基础[13]。Xia等[28]发现，表达DNase Ⅰ的腺病毒(即AAV-DNaseⅠ)可通过抑制中性粒细胞募集、抑制NETs形成、增加CD8+T细胞数量、减少CD4+T细胞数量来调节TME中的先天性及获得性免疫应答，而CD8+T细胞是抗原特异性抗肿瘤免疫的主要效应器，可以识别并杀死肿瘤细胞。此外，有研究发现，肿瘤细胞通过募集中性粒细胞使其分泌CCL17而将Tregs募集到肿瘤部位，此过程损害了免疫系统对肿瘤的杀伤能力[29]。因此，NETs可能通过作用于TME中的免疫细胞协助肿瘤进行免疫逃逸，从而促进肿瘤的发生发展。

2.3 对内皮细胞的影响 NETs中的多种成分可通过影响内皮细胞而促进肿瘤微血管的生成。Jung等[30]发现，组蛋白作为NETs的重要组成部分，能在胰腺癌中促进内皮细胞小管形成，而组蛋白的抑制剂(如肝素或多聚唾液酸)可逆转以上作用。此外，NE能通过诱导TME内的血管生成促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，其可能的机制是NE导致肿瘤抑制因子失活，从而促进TME中的血管生成[31]。Wilson等[32]认为CG不仅具有降解细胞外基质的功能，还可通过刺激血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)而促进新生血管形成，使转移灶拥有丰富的血供，从而继续生长；对骨髓转移癌小鼠模型使用CG抑制剂，可使其微血管密度低于正常对照。另外，有研究显示，结直肠癌患者肿瘤细胞产生的NETs能够促进人脐静脉内皮细胞转化为促凝表型，即表现为磷脂酰丝氨酸(PS)外露增加、凝血时间缩短、大量纤维蛋白形成，从而促进肿瘤相关血栓形成[33]。

2.4 对肿瘤相关成纤维细胞的影响 肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是TME中活化的成纤维细胞，可分泌多种细胞因子，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[34]。Takesue等[35]通过体内及体外实验证实，NETs可作用于胰腺导管腺癌中的CAFs，从而促进肝转移，而NETs抑制剂可减少肿瘤组织中CAFs的募集，进而抑制肝转移。Munir等[20]进一步研究发现，在黑色素瘤及胰腺癌中，这种作用是CAFs产生的淀粉样蛋白β介导的，抑制NETs或淀粉样蛋白β均能抑制肿瘤的生长，并恢复中性粒细胞的抗肿瘤活性。

2.5 对细胞外基质及细胞因子的影响 NETs还可通过调控TME中的细胞外基质及细胞因子而影响肿瘤的进展。一方面，Albrengues等[11]发现，持续的肺部炎症会导致在休眠癌细胞周围形成NETs，作为NETs的重要组成部分，NE及MMP9依次作用于细胞外基质中的层黏连蛋白-111，使其暴露出一个新的表位，该表位能与肿瘤细胞表面的整合素α3β1结合，从而使休眠的肿瘤细胞苏醒，进一步促进肿瘤的复发与转移。另一方面，在胰腺癌中，胰腺癌细胞可产生IL-17，后者通过募集中性粒细胞诱导NETs的产生；抑制IL-17可增强免疫检查点抑制剂(如PD-1、CTLA4)的敏感性，而抑制中性粒细胞或PAD4依赖的NETosis能产生类似的效应[36]。

3 NETs的临床应用前景

3.1 作为肿瘤标志物的临床应用前景 NETs可作为多种肿瘤的标志物，与肿瘤的分期、分型密切相关。Rayes等[24]研究发现，NETs水平在肺癌、胃癌及食管癌患者中明显升高，晚期患者明显高于早期患者，且仅有肿瘤也可诱导NETosis，不依赖于手术应激及炎症反应。Zhang等[15]发现，外周血NETs水平在以下人群中从高到低依次为：胃腺癌晚期患者、胃腺癌术前患者、胃腺癌术后患者、胃良性病变患者、健康志愿者；且NETs水平与肿瘤的分型及预后相关。Park等[10]在人乳腺癌组织标本中检测到NETs，其中三阴性乳腺癌中表达量最高，Luminal型乳腺癌中表达量很少，甚至不表达。还有研究发现，NETs广泛存在于乳腺癌及结肠癌患者的肝转移病灶中，而跨膜蛋白CCDC25作为存在于肿瘤细胞表面的NETs DNA受体，可增强肿瘤细胞的活性，促进肿瘤的转移[26]。血清中NETs的水平及肿瘤细胞表面CCDC25的表达量可作为生物标志物，特异性地预测早期乳腺癌患者肝转移的风险。因此，NETs作为生物标志物在肿瘤的分期、分型及预测肿瘤进展和预后方面将发挥重要的作用。

3.2作为肿瘤治疗靶点的临床应用前景 虽然目前尚无临床试验评估靶向NETs对于肿瘤发生、发展、转移及复发的影响，但已有研究提示抑制NETs对肿瘤的早期防治具有重要意义。van der Windt等[37]发现，抑制NETs可使非酒精性脂肪肝诱发的肝癌发生率降低50%。同样地，使用NE抑制剂可以明显抑制NETs形成，阻止肿瘤细胞与肝毛细血管窦及肺毛细血管网内皮细胞的黏附，进而减少肿瘤细胞向肝脏与肺部转移[27]。另外，DNase Ⅰ或PAD4抑制剂可抑制NETs的形成，进一步抑制肿瘤的发生发展[9-13,28]，且PAD4抑制剂或DNase Ⅰ也可减轻NETs介导的肿瘤相关肾功能损伤[38]。目前，NE抑制剂及DNase Ⅰ已用于其他呼吸系统疾病的治疗[39]。以上研究提示，NETs作为肿瘤治疗的靶点可能会有很好的应用前景，当然，考虑到不同肿瘤的特异性、不同治疗方式的影响及肿瘤患者与动物模型的差异，将NETs抑制剂真正应用于临床还须谨慎。

4 总结与展望

中性粒细胞一直以来被认为是人体重要的防御机制，可通过NETs诱捕并杀灭有害病原体。目前研究发现，NETs在多种肿瘤中高表达，TME中的成分能够刺激NETs的形成，而NETs也能通过影响TME中的肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞及细胞外基质等促进肿瘤增殖、侵袭及转移。以上研究结果提示，NETs作为预测肿瘤进展及预后的标志物，以及潜在治疗靶点将有很好的应用前景。但由于受到肿瘤类型、治疗方式及肿瘤患者与动物模型差异的影响，具体的作用机制还需进一步探讨。