甲壳素季铵盐作为新型液相色谱固定相的研究

单绪才，石 杰，胡晓薇，陈 锐，雷福厚，李国祥*

(1.湖北民族大学 化学与环境工程学院,湖北 恩施 445000;2.仙桃市爱国卫生运动委员会办公室,湖北 仙桃 433005;3.广西民族大学 化学化工学院,南宁 530006；4.广西民族大学 广西林产化学与工程重点实验室,南宁 530006)

高效液相色谱法是经典的色谱方法之一，具有操作简便、稳定性好、分析速度快且适用范围广的优点，在化学化工、生物医药、食品、环境等领域应用广泛[1-2].色谱固定相是色谱技术发展最核心的部分，因此开发选择性高、分离效果好的新材料作为液相色谱固定相意义重大.以纤维素和直链淀粉为代表的天然多糖作为液相色谱固定相，在手性分离领域已显示出了独特的魅力[3].甲壳素是N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的线性高分子，是一种来源丰富的天然碱性多糖，具有优异的生物相容性和可降解特性.但由于甲壳素分子间和分子内存在丰富的氢键，使得常见溶剂较难溶解甲壳素，而限制了该生物质资源的广泛应用[4-6].通过化学方法将功能基团引入甲壳素分子，改善甲壳素的溶解性，从而使其更易成型加工是充分利用甲壳素资源的新途径.其中，醚化改性是甲壳素化学改性的重要方法之一[7-9].甲壳素醚类衍生物具有易絮凝、抑菌、成膜性好等特性，特别是其分子骨架上拥有丰富的手性碳，因此成为一种有潜在应用前景的手性分离材料[10].在前期工作中，本研究小组已经成功合成了甲壳素季铵盐，并首次将其作为液相色谱手性固定相应用于四氢萘胺外消旋体的分离[11].

近年来，一些位置异构体，如溴硝基苯、硝基苯胺和二硝基苯等通过手性固定相得到了较好的分离[12].邻甲苯胺及其位置异构体可作为染料、农药、医药等制品的中间体；然而它们均具有一定毒性，比如邻甲苯胺可经皮肤接触在人体内生成高铁血红蛋白，长期低浓度接触会引发中毒性肝炎、化学性膀胱炎等，因此已被世界卫生组织纳入一类致癌物质名录[13].邻甲苯胺及其异构体常用的分离手段是采用气相色谱—质谱法[14].但由于邻甲苯胺及其位置异构体的沸点接近，且分子极性差别小，当采用常用方法检测时常出现假阳性结果.此外，有研究显示一些手性固定相对单环、稠环类芳香烃化合物表现出了较好的拆分能力[15].受相关文献启发，本小组尝试将甲壳素季铵盐作为液相色谱固定相，进一步探讨其对甲苯胺位置异构体、芳香烃类化合物的色谱分离性能，从而为该类新型液相色谱固定相的广泛应用提供新的科学依据.

图1 甲壳素季铵盐的合成Fig.1 Synthesis of quaternized chitin

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

仪器包括高效液相色谱仪(大连依利特有限公司，Agress 1100)、紫外-可见波长检测器(大连依利特，D1100)、色谱数据工作站(大连依利特，Elitapex)、液相色谱装柱机(北京海德利森科技有限公司)、不锈钢色谱空柱(南京茂甘仪器科技有限公司，250 mm×4.6 mm).试剂包括甲壳素原料(山东金湖甲壳素有限公司，工业级)、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(百灵威科技有限公司)、球形硅胶(青岛美高化工有限公司，粒径5 μm)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(上海阿达玛斯试剂有限公司).邻甲苯胺、对甲苯胺、间甲苯胺均购于阿拉丁试剂公司，其余试剂均为国产分析纯.

1.2 甲壳素季铵盐液相色谱固定相

甲壳素季铵盐按文献方法制备[8,11]，合成路线如图1所示.首先配制NaOH和尿素质量浓度分别为8%和4%的水溶液，将2 g甲壳素溶于100 mL该溶液中得到约2%的甲壳素溶液.接着，将该溶液搅拌稀释后与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵反应，待反应结束用稀盐酸调节pH至中性.最后待样品经透析7 d、抽滤、浓缩、冷冻干燥环节处理后，即得到甲壳素季铵盐样品.采用类似方法，改变甲壳素与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵反应的物质的量之比，可获得不同取代度的甲壳素季铵盐，记为QC1、QC2、QC3、QC4，其取代度分别为0.45、0.69、0.81与0.89；改变甲壳素的分子量，得到不同分子量的甲壳素季铵盐，记为QC5、QC6、QC7、QC8，其重均分子量分别为2.84×105、2.29×105、1.22×105、0.97×105.然后将甲壳素季铵盐QC1～QC8分别涂敷于氨丙基硅胶表面，制成甲壳素季铵盐手性固定相(chiral stationary phase,CSP)，依次将其命名为CSP1、CSP2、CSP3、CSP4、CSP5、CSP6、CSP7、CSP8.采用湿法装柱，取涂敷硅胶4 g，用液体石蜡、正己烷/异丙醇制备成约15 mL匀浆液，在40 MPa压力下装柱，得到8根液相色谱柱.

1.3 液相色谱实验条件

采用体积比为90∶10的正己烷/异丙醇作流动相，选择0.5 mL/min的流速，254 nm的检测波长，柱温设为25 ℃，流动相经0.45 μm有机微孔膜过滤后超声脱气，样品用流动相配制并用0.45 μm微孔膜过滤.以邻甲苯胺、对甲苯胺、间甲苯胺，以及苯、萘、蒽作为2组分析样品，考察甲壳素季铵盐固定相对甲苯胺位置异构体和芳香烃类化合物的分离性能.通过保留时间，计算分离度：

Rs=2(t2-t1)/(W1+W2)，

其中，t1和t2分别是分离组分1、2的保留时间，W1和W2是分离组分的峰宽[1].色谱柱死时间t0用1,3,5-三叔丁基苯测定，理论塔板数N以苯作为溶质测定.

2 结果与讨论

2.1 甲壳素季铵盐固定相对甲苯胺位置异构体的分离

为了考察甲壳素季铵盐固定相对位置异构体的分离性能，本实验选择邻甲苯胺、对甲苯胺、间甲苯胺3种位置异构体为1组样品分子.甲苯胺位置异构体在CSP3、CSP4、CSP8固定相上的色谱图如图2所示.将制备的系列甲壳素季铵盐作为固定相分别对3种甲苯胺位置异构体进行拆分，结果如表1所示.由图2、表1可知，所有固定相对甲苯胺异构体均表现出了一定的拆分能力.

首先，邻甲苯胺和其他2种异构体在所有甲壳素季铵盐固定相上都达到完全基线分离，平均分离度为3.27，最大分离度达到4.91.较高的分离度表明，在本实验条件下，甲壳素季铵盐液相色谱固定相能高效拆分邻甲苯胺和它的2种(对，间)甲苯胺异构体.

其次，研究对甲苯胺和间甲苯胺在使用不同取代度的甲壳素季铵盐固定相情况下的拆分特性.在取代度较高的CSP3、CSP4固定相上，对甲苯胺和间甲苯胺均可得到拆分，且当取代度为0.81时，最大分离度Rs(对，间)为0.48；而在取代度相对较小的CSP1、CSP2固定相上，对甲苯胺和间甲苯胺均没有得到拆分(表1).这说明甲壳素分子结构上的季铵基团扮演着重要角色；这可能是因为高取代的甲壳素季铵盐分子中季铵基团相对较多，与甲苯胺位置异构体中的氨基有着更强的相互作用.

再次，在同样实验条件下研究了对甲苯胺和间甲苯胺在使用不同分子量的甲壳素季铵盐固定相情况下的拆分特性.在分子量较大的CSP5、CSP6、CSP7固定相上，对甲苯胺和间甲苯胺均没有得到拆分；而在分子量相对较小的CSP8固定相上，对甲苯胺和间甲苯胺得到拆分，分离度Rs(对，间)为0.33(表1).这说明甲壳素季铵盐的分子量对甲苯胺这2种异构体的分离同样有着重要影响；这可能是因为分子量较低的甲壳素季铵盐分子链柔顺性减弱、刚性增强，涂敷过程中分子链不易发生缠绕和团聚，能均匀分布于硅胶表面，从而使得在流动相的作用下不同结构的甲苯胺分子与季铵基团的相互作用更为充分，因此拆分性能较好[3].

综上所述，对甲壳素季铵盐固定相来说，较小的分子量和较高的取代度更有助于甲苯胺位置异构体的拆分.

(a) 甲壳素季铵盐固定相CSP3(b) 甲壳素季铵盐固定相CSP4(c) 甲壳素季铵盐固定相CSP8图2 甲壳素季铵盐固定相CSP3、CSP4、CSP8对邻甲苯胺(o)、对甲苯胺(p)、间甲苯胺(m)异构体的分离谱图Fig.2 Chromatograms of toluene position isomers(o-toluidine，p-toluidine and m-toluidine) on quaternized chitin stationary phases (CSP3,CSP4 and CSP8)

2.2 甲壳素季铵盐固定相对芳香烃类化合物苯、萘、蒽的分离

为了考察甲壳素季铵盐固定相对芳香烃类化合物的分离性能，本实验选择苯、萘、蒽为1组样品分子.苯、萘、蒽在CSP4、CSP7、CSP8固定相上的色谱图如图3所示.将系列甲壳素季铵盐固定相分别对苯、萘、蒽3种芳烃进行拆分，结果也列于表1.由图3、表1可知，除了CSP5以外，所有甲壳素季铵盐固定相对苯、萘、蒽的混合物均表现出了较好的拆分性能，被分离组分通过CSP3、CSP4、CSP7、CSP8这4种固定相达到完全基线分离.

表1 甲苯胺位置异构体及芳香烃类化合物苯、萘、蒽在8根甲壳素季铵盐色谱柱上的分离度Tab.1 Resolution of toluidine isomers,benzene,naphthalene and anthracene on the eight quaternized chitin columns

对不同取代度的CSP1～CSP4固定相，被分离组分的分离度总体上随着甲壳素季铵盐取代度的增加而增大，最大分离度Rs(苯，萘)和Rs(萘，蒽)分别为1.28和1.44(表1)；这表明对于苯、萘、蒽组分的拆分，甲壳素分子结构中的季铵基团同样扮演着重要角色.这可能是因为在芳香烃类化合物的分离过程中除了苯环的空间效应外，季铵基团和苯环的电子效应也起着一定的作用.

对不同分子量的CSP5～CSP8固定相，被分离组分的分离度总体上随着甲壳素季铵盐分子量的增加而呈现先增大再降低的趋势，最大分离度Rs(苯，萘)和Rs(萘，蒽)分别为1.29和1.33(表1)；这同样说明甲壳素季铵盐分子量大小对苯、萘、蒽芳香烃的分离也有着重要影响.这可能是因为分子量较小的甲壳素季铵盐分子更有利于季铵基团与被分离组分间的相互作用，从而达到分离的目的.

(a) 甲壳素季铵盐固定相CSP4 (b) 甲壳素季铵盐固定相CSP7 (c) 甲壳素季铵盐固定相CSP8图3 甲壳素季铵盐固定相CSP4、CSP7、CSP8对苯(α)、萘(β)、蒽(γ)的分离谱图Fig.3 Chromatograms of benzene (α),naphthalene (β) and anthracene (γ) on quaternized chitin stationary phase (CSP4,CSP7 and CSP8)

3 结论

以系列甲壳素季铵盐为液相色谱固定相，分别以3种甲苯胺位置异构体和3种芳香烃类化合物为样品分子，考察了甲壳素季铵盐固定相对这2类样品的分离性能.研究发现甲壳素季铵盐新型液相色谱固定相对这2类样品分子均有明显的分离能力，且拆分效果和甲壳素季铵盐的分子结构密切相关.其中，甲壳素季铵盐分子链中的季铵基团扮演着重要角色；此外，分子量也有着重要影响.本研究为设计和构筑甲壳素新材料作为新型液相色谱固定相提供了新的思路，拓展了甲壳素可再生资源在色谱分离领域中的应用.