响应面优化富硒四季豆叶蛋白提取工艺及抗氧化活性研究

吴丽雯，龙 澜，袁名远，郭 阳，罗 凯*，张 强#

(1.湖北民族大学 生物与食品工程学院，湖北 恩施 445000；2.恩施土家族苗族自治州农业科学院，湖北 恩施 445000；3.西南大学 农学与生物科技学院，重庆 400715)

硒是生物体必需的微量元素之一[1]，它在生物体内具有抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、免疫调节、抗炎、防克山病和大骨节病等多种重要生理功能[2-8].硒摄入不足或过多都会导致疾病的发生[9]，如硒缺乏会导致人体抗氧化功能障碍[10].科学膳食补硒是一种有效、安全的补硒形式，可通过植物转化、动物转化、微生物转化等途径将有毒的无机硒转化为安全的有机硒[11].硒蛋白是植物中有机硒的主要存在形态之一[12]，通常能以水、盐、酸、碱、酶、醇等化学方法、物理方法和其他辅助方法提取[13].

四季豆(Kidney bean)是普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)的中文别名；在分类学上属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoidae)菜豆族(Phaseoleae)菜豆属(Phaseolus)菜豆种，是一种一年生草本植物[14].四季豆原产于中南美洲，15世纪后传入中国.由于其对土壤具有广泛适应性，在我国各地均有种植[15].四季豆既可作为有嫩荚的蔬菜食用，其干籽也可作为散装食品食用，倍受大众青睐；这是归因于其嫩荚和干籽粒中均含有人体所必需的8种氨基酸以及其他丰富的营养成分[16-17].

四季豆叶片是一种潜在的蛋白质资源，生物量大，品质好.然而，收获四季豆果实后，除小部分叶片可用作禽畜饲料外，其余大部分都被丢弃或者焚烧，因此造成了环境污染和资源浪费.目前，关于富硒四季豆叶蛋白(leaf protein of selenium-enriched kidney bean，SKP)的提取及其抗氧化活性研究的报道很少.本研究结合恩施州富硒的特点，采用响应面法优化了恩施地区SKP的碱提酸沉提取工艺，并研究了其体外抗氧化活性，以期为进一步开发SKP、提高其生物价值和经济价值提供参考.

1 材料与方法

1.1 原料

选用恩施本地四季豆(自留种)叶片，由恩施土家族苗族自治州农业科学院提供.采用叶面喷施硒肥的方法对四季豆叶片进行富硒处理，喷施硒溶液的质量浓度为0.048 g/m2(以硒计)，从苗期到开花前喷施硒肥5次，每次间隔7天，均匀喷洒至叶片上.

1.2 主要试剂

包括考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，由上海源叶生物公司提供;硒标准溶液,由国家有色金属及电子材料分析测试中心提供;盐酸、硝酸为国产优级纯，其他试剂均为国产分析纯.

1.3 主要仪器与设备

包括粉碎机(德清拜杰电器有限公司，BJ-800A)、电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗公司，DHG-9243BS-Ⅲ)、分析天平(德国Sartorius公司，BS-124S)、pH计(梅特勒公司，FE20K)、离心机(湖南湘立公司，TG16-WS/CenLee20R)、真空冷冻干燥机(宁波新芝公司，S-18N)、凯氏定氮仪(海能公司，K9840)、紫外-可见分光光度计(日本岛津公司，UV-1900)、全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司，Spectra Max190)、双道原子荧光光度计(北京海光仪器公司，AFS-9760).

1.4 试验方法

1.4.1 牛血清蛋白标准曲线的制备 采用考马斯亮蓝法(Bradford法)[18]绘制牛血清蛋白溶液标准曲线，其线性回归方程为y=0.005 5x+0.001 2，R2=0.999 6.

1.4.2 SKP提取工艺流程 碱提酸沉法不仅是提取植物叶片粗蛋白应用最多的方法[19]，也是适用于植物体内硒蛋白提取的方法[20].参考李雪[21]的方法并改进提取SKP：将富硒四季豆叶片采摘后于80 ℃烘箱中烘干，粉碎过80目筛；取一定量过筛后的富硒四季豆叶粉，溶于适量浓度的NaOH溶液，适当温度下加热浸提2 h，再经6 000 r/min离心处理20 min取上清液；之后采用最佳等电点法加入乙酸酸沉过夜，再经8 000 r/min离心处理10 min取沉淀物；最后将沉淀物提前预冻后进行真空冷冻干燥，得到SKP粉末.

1.4.3 SKP提取率的测定 采用1.4.1中的Bradford法，测试碱提离心后的富硒四季豆叶片上清液中的可溶性蛋白质含量，根据测得的牛血清蛋白标准曲线计算样品溶液中的蛋白质含量.SKP的蛋白质总含量按照《食品安全国家标准-食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5-2016)中凯式定氮法测定[22]，其蛋白质的质量分数为(53.46±0.09)%，SKP提取率计算公式为E=m1/m2×100%.式中：E为SKP提取率(%)；m1为上清液中SKP总量(mg)；m2为SKP总量(mg).

1.4.4 总硒含量的测定 参考《食品中硒含量的测定》(GB 5009.93-2017)，采用氢化物-原子荧光光谱法[23]测定富硒四季豆叶粉原料和碱提酸沉工艺最优条件下蛋白质中的总硒：C=m3/m4.式中：C为总硒含量(μg/g)；m3为样品中硒的质量(μg)；m4为样品质量(g).

1.4.5 SKP提取单因素试验 固定提取温度为60 ℃、料液比为1∶30 g/mL、NaOH溶液浓度为0.1 mol/L，考察提取时间(30、60、90、120、150、180 min)对SKP提取率的影响；固定提取时间为120 min、料液比为1∶30 g/mL、NaOH溶液浓度为0.1 mol/L，考察提取温度(50、55、60、65、70 ℃)对SKP提取率的影响；固定提取时间为120 min、提取温度为60 ℃、NaOH溶液浓度为0.1 mol/L，考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对SKP提取率的影响；固定提取温度为60 ℃、提取时间为120 min、料液比为1∶20 g/mL，考察NaOH溶液浓度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L)对SKP提取率的影响.

1.4.6 SKP提取响应面法优化试验 考虑到碱提酸沉法是先碱提后酸沉分步进行的，所以在单因素试验的基础上，确定提取时间A(min)、提取温度B(℃)、料液比C(g/mL)、NaOH浓度D(mol/L)为考察自变量，以SKP提取率为响应值，利用Design-Expert.V8.0.6.1软件，采用响应面法设计4因素3水平试验，得到优化提取SKP工艺的最佳参数；在最佳提取工艺参数下再确定酸沉的最适宜pH值.

1.4.7 验证试验 根据响应面法优化试验工艺，进行验证试验并重复3次，以验证工艺的可靠性和稳定性.

1.4.8 SKP等电点的确定 参考文献[24]并改进，在SKP提取工艺的最佳条件下测试其等电点，分别取SKP碱提液5份，每份10 mL，用乙酸将pH值调整为4.2、4.3、4.4、4.5、4.6；静置1 h后，通过离心处理(8 000 r/min，10 min)收集上清液，用Bradford法测定上清液中蛋白质的残留量.

1.4.9 氨基酸组成分析 按照《食品安全国家标准-食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124-2016)[25]测定SKP粉末中的氨基酸组成.

1.4.10 SKP体外抗氧化活性测定 DPPH自由基清除能力的测定参考倪庆圆[26]、Ahn等[27]的方法并加以改进.ABTS自由基清除能力的测定参考Perez等[28]的方法并加以改进；羟基自由基清除能力的测定参考Mojica等[29]的方法并加以改进；超氧阴离子自由基清除能力的测定参考金小乂等[30]的方法并加以改进.4种自由基的清除率计算公式为：A=[1-(A2-A0)/A1]×100%.式中：A为自由基清除率(%)；A2为样品组吸光值；A1为对照组吸光值；A0为空白组吸光值.

1.5 数据处理

单次试验重复3次，测定结果以(平均值±标准差)表示，使用Excel 2017处理数据，使用SPSS 16.0进行显著性分析，使用OriginPro 9.1绘图.

2 结果与分析

2.1 总硒和蛋白质的测定

结果表明，亚硒酸钠溶液在0～50 μg/L质量浓度范围内与荧光值有良好的线性关系，其线性回归方程为y=93.923x-5.395，R2=0.999 8.此条件下测得富硒四季豆叶片总硒和碱提酸沉工艺最优条件下SKP的总硒含量分别为(1.40±0.10)μg/g、(2.29±0.06)μg/g，均达到《富硒含硒食品与相关产品硒含量标准》(DB61/T 556-2018)中规定.采用凯式定氮法测定富硒四季豆叶片、碱提酸沉工艺最优条件下的蛋白质质量分数，分别为(26.02±0.14)%、(53.46±0.09)%；说明SKP是一种良好的植物蛋白资源，可进一步开展分离纯化研究.

2.2 SKP提取单因素试验结果

2.2.1 提取时间对蛋白提取率的影响 如图1(a)所示，随着浸提时间的增加，SKP的提取率先增加后降低，说明浸提时间对SKP的提取率有一定的影响.当浸提时间为120 min时，蛋白提取率最高，为(32.02±1.71)%；但在提取时间120 min后，随着提取时间的增加提取率反而下降，可能是因为蛋白质与碱液反应饱和后导致蛋白质溶出量较少、且反应时间过长导致SKP发生部分变性或者降解[31]；因此，选择120 min为合适的提取时间.

2.2.2 提取温度对蛋白提取率的影响 如图1(b)所示，随着提取温度的不断升高，SKP的提取率首先呈现上升趋势，可能是由于蛋白质和碱液中的水分子、盐离子等其他物质的相互作用随着温度升高而加强[32]，促使蛋白质在60 ℃时达到最大溶出量.但当提取温度超过60 ℃时，蛋白质提取率下降，可能是由于温度过高导致蛋白质变性、水解，或因氨基酸的外消旋作用而影响了蛋白质的溶出[33].因此，适宜的提取温度应控制在60 ℃.

2.2.3 料液比对蛋白提取率的影响 如图1(c)所示，首先蛋白提取率随着料液比增加而迅速上升，这可能是由于初始反应阶段富硒四季豆叶粉末在溶液体系中更易分散，蛋白质更好溶出.但随着料液比的逐渐增大，一方面蛋白质质量浓度和黏度逐渐降低，另一方面蛋白质的溶解度可能达到了饱和状态[34]，因此提取率趋于平缓.考虑到料液比过大会导致蛋白质提取对工业资源消耗增加，因此，选择合适的提取料液比应是1∶20 g/mL左右.

2.2.4 NaOH溶液浓度对蛋白提取率的影响 如图1(d)所示，SKP提取率随着NaOH溶液浓度的增加而增加，当NaOH浓度增加到0.2 mol/L之后，蛋白质提取率提高幅度不大.这说明大部分蛋白质在NaOH溶液浓度为0.2 mol/L前就能够溶出，这是因为碱液浓度逐渐增加时蛋白质之间的作用大于蛋白质和水之间的作用所致[35].一般来说，由于高碱度环境有助于通过破坏氢键、破坏叶组织和提高蛋白质溶解度来提取植物叶蛋白，因此强碱性溶液能促进叶蛋白的溶解和提取[36].因此，选择提取SKP的碱液浓度应控制在0.2 mol/L左右较适宜.但是，试验发现碱液提取后的SKP颜色为深褐色，影响感官；这可能是因为高碱度条件下美拉德反应迅速发生，产生了黑褐色物质，导致了提取液中非蛋白质含量的增加，分离效果下降[37].若将其开发为产品可考虑增加后续的脱色和纯化处理.

(a) 提取时间对蛋白提取率的影响 (b) 提取温度对蛋白提取率的影响

(c) 料液比对蛋白提取率的影响 (d) NaOH浓度对提取率的影响图1 SKP提取单因素试验结果Fig.1 Single factor test results of SKP extraction rate

表1 响应面设计试验因素水平及编码Tab.1 Experimental factor leveland coding table of response surface design

2.3 SKP提取响应面法优化试验结果

2.3.1 响应面法试验方案及结果 响应面试验因素水平及编码见表1.根据单因素试验结果，选取提取时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)、NaOH溶液浓度(D)4个影响因素作自变量，采用Box-Benhnken设计4因素3水平试验对SKP提取工艺进行优化，结果如表2所示.

2.3.2 响应面模型的建立与分析 根据Design-expert 12.0对响应面模型进行多元回归拟合分析，获得了以蛋白质提取率为响应值的回归方程：

Y=29.26+0.25A+0.046B-0.23C+0.011D+0.098AB-0.66AC-0.25AD+

0.28BC+0.31BD+0.20CD-1.96A2-0.50B2-1.16C2-0.71D2，

由回归方程可知，A、B、C、D4个因素一次项系数的绝对值依次可排列为A>C>B>D，确定了各因素对富硒蛋白提取率的影响顺序为：提取时间>料液比>提取温度>NaOH溶液浓度.

对响应面回归模型进行方差分析，结果如表3所示，回归模型F值为25.92，模型P值<0.000 1，表明试验模型极显著，试验方法可靠；失拟项P=0.884 0(>0.05)，表明失拟项不显著，未知因素对试验影响不大.相关系数R2=0.962 9，模型预测值与真实试验值在试验范围内有较好的拟合度.A2、B2、C2、D2对蛋白提取率的影响达到极显著水平(P<0.01)，提取时间、料液比对叶蛋白提取率的影响达到显著水平(P<0.05).

表2 SKP提取响应面优化试验结果Tab.2 Response surface optimization experimental results extracted by SKP

表3 回归模型方差分析Tab.3 ANOVA of regression model

2.3.3 响应面交互作用分析 图2为提取时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)、NaOH溶液浓度(D)4因素的交互作用响应面图.在响应面图中，若由顶点向下的曲面坡度越大，则说明图中的单因素对响应值的影响越大.在二维等高线图中，等高线线圈的椭圆程度体现不同的意义：若图中两个单因素对响应值的交互作用越显著则线圈越椭圆，相反不显著则线圈越圆.提取时间和料液比两因素交互作用的响应面曲面较陡峭，说明这两项交互作用显著；而提取温度和NaOH溶液浓度交互作用的响应面曲面则较平缓，对应的等高线圈也较圆，说明这两项交互作用不显著；这与方差分析结果一致.

2.3.4 验证试验 经过响应面法优化后得到SKP的碱提工艺条件为：提取时间为122.29min、提取温度为60.92 ℃、料液比为1∶18.95g/mL、NaOH溶液浓度为0.22mol/L；此条件下叶蛋白提取率为30.06%.综合考虑实际情况，对SKP的提取工艺最优条件进行了修正：提取时间为120min、提取温度为60 ℃、料液比为1∶20g/mL、NaOH溶液浓度为0.2mol/L；此条件对富硒四季豆叶片进行提取，实际提取率为(29.92±1.28)%，与提取率理论值30.06%相差不大，表明该模型能较好地预测SKP的提取.

2.4SKP等电点测定结果分析

在最优提取工艺条件下，采用等电点沉淀法将蛋白质沉淀下来，用Bradford法测得上清液在波长595nm处的吸光度大小与叶蛋白含量呈正相关[38]；因此，上清液中叶蛋白含量最低时的pH值即是沉淀SKP的最佳pH值.如图3所示，吸光度随着pH值的升高先降低后增加，当pH值为4.4时吸光度最低，即蛋白质接近完全沉淀.因此，SKP沉淀的最适pH值为4.4.

图2 各因素交互作用对蛋白质提取率影响的响应面图Fig.2 Response surface three-dimensional map of the effect of the interaction of various factors on the protein extraction rate

图3 SKP等电点测试Fig.3 Determination ofisoelectric point of SKP

2.5氨基酸组成分析

SKP中各氨基酸含量及占总氨基酸比例见表4.对SKP进行氨基酸检测，结果表明其含有16种氨基酸，但由于色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和胱氨酸在酸性条件下已水解，色氨酸被破坏，其他氨基酸侧链酰胺基水解为羧基导致未被检测到[28].SKP中含有8种人体必需氨基酸中的7种(色氨酸除外)，占总氨基酸比例为35.96%；含量从高到低依次为：亮氨酸(Leu)>苯丙氨酸(Phe)>缬氨酸(Val)>赖氨酸(Lys)>酪氨酸(Tyr)>异亮氨酸(Ile)>蛋氨酸(Met).此外，SKP的非必需氨基酸中谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的含量较高.疏水氨基酸约占44.86%，高含量的疏水氨基酸为制备抗氧化活性蛋白、肽提供了物质基础[38].

表4 SKP氨基酸组成含量及占总氨基酸比例Tab.4 Analysis of SKP amino acid composition content and proportion of total amino acids

2.6最优条件下SKP体外抗氧化活性分析

使用SPSS16.0软件来计算半抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50).IC50值可表示不同抗氧化剂的抗氧化性强弱：值越低表明其自由基清除能力越强[39].

2.6.1DPPH自由基清除活性 如图4(a)所示，在样品质量浓度为0.5～3.0mg/mL范围内，Vc比SKP对DPPH自由基有更明显的清除作用.随着SKP质量浓度的增加，其DPPH自由基清除能力从(72.05±0.1)%不断增大到(90.91±0.31)%，在样品浓度0.5～2.0mg/mL范围内变化较为明显，在样品浓度2.0～3.0mg/mL范围内变化平缓，IC50=0.167mg/mL.金小乂等[30]研究发现无论是低硒(37.81μg/g)还是高硒(64.78μg/g)的花生秧蛋白，在浓度0.25～2.0mg/mL范围内对DPPH自由基的清除率均能达到了70%，之后趋于稳定；表明硒与蛋白在清除自由基方面有协同作用.

(a) DPPH自由基清除率 (b) ABTS自由基清除率

(c) 羟基自由基清除率 (d) 超氧阴离子自由基清除率图4 SKP体外抗氧化活性试验结果Fig.4 SKP in vitro antioxidant test results

2.6.2ABTS自由基清除活性 如图4(b)所示，在样品浓度为0.5～3.0mg/mL范围内，Vc随着浓度的增加对ABTS自由基的清除效果变化不大；但SKP随着质量浓度的增加其对ABTS自由基的清除能力增加幅度较大，从(36.73±0.74)%不断增大到(98.30±0.23)%，IC50=0.892mg/mL，且当浓度为3.0mg/mL时与Vc的自由基清除率接近.

2.6.3 羟基自由基清除活性 如图4(c)所示，在样品浓度为0.5～3.0mg/mL范围内，相对于SKP而言，Vc对羟基自由基清除效果更明显；随着SKP质量浓度的增加其羟基自由基清除能力从(23.89±0.56)%不断增大到(71.67±0.57)%，IC50=1.51mg/mL，但与Vc的自由基清除率始终有差距.张瑞等[40]的研究表明低、中、高硒含量的核桃蛋白在浓度为0.2～1.0mg/mL范围内对羟基自由基的清除能力均会随着样品浓度增加而增大，且高硒含量的核桃蛋白清除羟基自由基的能力优于低、中硒含量的核桃蛋白.

2.6.4 超氧阴离子自由基清除活性 如图4(d)所示，在样品浓度为0.5～3.0mg/mL范围内，Vc对超氧阴离子自由基清除能力更明显；而随着SKP质量浓度的增加，其对超氧阴离子自由基清除能力从(41.70±0.16)%增大到(53.55±0.41)%，IC50=2.00mg/mL，但同浓度下清除率远低于Vc.马玲等[41]发现富硒平菇水溶性蛋白在浓度为1.0mg/mL时对超氧阴离子自由基的清除率达到最大值51.9%.成华等[42]研究发现海水钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)C-藻蓝蛋白富硒后会体现出较高的超氧阴离子自由基清除能力.不同来源的硒蛋白对自由基的清除能力有所差异，可能是因为各类硒蛋白结构不同导致其功能高低也有差距[43].

3 结论

以恩施富硒四季豆叶片为材料，采用碱提酸沉法提取SKP；通过单因素试验和响应面法确定了SKP的最佳提取工艺条件为：提取时间为120min、提取温度为60 ℃、料液比为1：20g/mL、NaOH溶液浓度为0.2mol/L；在此条件下叶蛋白的提取率为(29.92±1.28)%.氨基酸分析表明，该蛋白有人体必需的7种氨基酸，占总氨基酸比例为35.96%；疏水氨基酸占比约44.86%，为制备抗氧化活性蛋白、肽提供了物质基础.SKP对自由基的清除能力在浓度0.5～3.0mg/mL范围内随着蛋白质量浓度的增加而增大，表明SKP的添加量与自由基的清除率具有一定的协同效应；而且SKP对自由基的清除能力存在差异，这可能是由于SKP的硒蛋白结构不同所致.但制备的SKP样品颜色较深，若计划在后续研究中进一步探索相关产品的开发，可考虑脱色和纯化处理.