HA-SA复合微凝胶的制备与评价

胡婕，李红卫，付艳平，余丽，文治杰，胡燕

（中南民族大学 药学院&民族药学国家示范中心，武汉 430074）

水凝胶是一种亲水、稳定但不溶于水的三维网状结构［1］，因其良好的生物组织相容性，在生物医学领域中应用非常广泛.微凝胶更是由于粒径小、载药量高、生物相容性好、且环境响应性灵敏，在药物缓控释系统中的应用具有独特的优势［2-3］.

海藻酸钠（sodium hyaluronate，SA）是从褐藻类海带或者马尾藻中提取出来的高分子多糖，具有制剂辅料所需要的稳定性、溶解性、粘性和安全性，常被用作药用辅料［2-3］.但是纯SA-Ca2+制备的水凝胶存在药物突释和稳定性差的缺点，这是SA水凝胶在缓控释制剂领域上应用受到限制的主要原因［4］.透明质酸（hyaluronic acid，HA）是广泛存在于皮肤组织、结缔组织和神经组织中的一种糖胺聚糖，具有优异的生物相容性和生物降解性能，经过化学交联后形成的HA水凝胶稳定性良好［5-6］，但HA具有对酸碱环境不敏感的缺点，导致药物在胃肠道中不容易释放［7-9］.本研究将具有生物相容性和生物降解性的天然高分子材料SA和HA结合［10］，通过乳化法制备得到一种对pH敏感的具有互穿网络结构的复合微凝胶，该微凝胶不仅解决了材料自身存在的缺陷，而且制备出的HA-SA复合微凝胶有明显的pH敏感性，可控制药物缓慢持久释放，在药物递送和治疗肠道疾病中具有潜在价值［11-13］.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

海藻酸钠（SA）、透明质酸（HA，食品级）、姜黄素、二甲双胍、吲哚美辛（上海阿拉丁）；液体石蜡、司盘、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）、己二酸二酰肼（ADH）、无水氯化钙、氢氧化钠、磷酸二氢钠、无水乙醇均为分析级（国药集团）.

1.2 复合微凝胶的制备

1.2.1 复合微凝胶的交联原理

HA-SA复合水凝胶的制备原理主要分为两部分.首先为HA分子中的羧酸根与交联剂己二酸二酰肼（ADH）分子中的氨基在碳二亚胺（EDC）/N-羟基丁二酰亚胺（NHS）催化条件下反应，脱水缩合形成了酰胺键，得到HA-ADH网络结构；SA在Ca2+溶液中发生非共价键的物理交联，形成了SA-Ca2+网络结构，两者混合，形成了一种有互穿网络结构的复合微凝胶，交联原理见图1.

图1 HA-SA复合微凝胶交联原理图Fig.1 Cross-linkingmechanismof HA-SA compositemicrogels

1.2.2 复合微凝胶的制备过程

称取0.4 g SA和0.2 g HA于烧杯中，加入20 mL蒸馏水，磁力搅拌溶解后往烧杯中加入ADH和催化剂EDC/NHS，继续搅拌至所有原料完全溶解后分为两部分.一部分样品加入液体石蜡和司盘，继续机械搅拌20 min乳化，将乳化后的乳液滴加到新鲜配制的2.5%CaCl2溶液中，搅拌40 min后，放置几分钟，待所制备的微凝胶沉积于烧杯底部，弃上层液体，再将微凝胶清洗风干即得空白的HA-SA复合微凝胶.而另一部分采用直接滴制法加入到2.5%CaCl2溶液制备HA-SA宏观水凝胶，后续处理方法相同.制备流程见图2.

图2 HA-SA复合微凝胶制备流程图Fig.2 Flow chart of the preparation process of HA-SA composite microgels

1.3 复合微凝胶的表征

将新鲜制备及自然风干后的水凝胶、复合微凝胶分别平铺于白色的背景上，观察并拍照；取少量冷冻干燥后的微凝胶样品，以1∶99的比例将待测样品与溴化钾充分混合，研磨后制片进行红外分析（IR）；经X射线衍射仪（XRD）来测定冷冻干燥后的HA-SA微凝胶样品的晶型结构.管压：40 kV，扫描速度：1°/min，2θ范围：4°～40°.

1.4 HA-SA复合水凝胶的溶胀测试

称取风干后的复合水凝胶（质量W0）后，放入37℃中pH 1.2的模拟胃液（SGF）中，每隔0.5 h取出，擦干，记录质量（Wt）.2 h后更换到pH 7.4的模拟肠液（SIF）中，记录质量（Wt）的变化.最后使用公式（1）计算HA-SA复合水凝胶的溶胀率：

式中，SR为溶胀率，Wt为溶胀后的复合水凝胶质量，W0为复合水凝胶的初质量.

1.5 复合微凝胶的释药行为研究

取0.05 g的HA-SA微凝胶，加入SGF 50 mL，于37℃，100 r/min恒温振荡，每隔0.5 h取样4 mL，同时补充同体积新鲜释放介质；2 h后将SGF更换为SIF，同样的方法继续进行测试.将模型药物姜黄素［14］、吲哚美辛［15］及二甲双胍经紫外分光光度计分别于430、320、233 nm波长处测定吸光度得标准曲线，计算药物浓度后由公式（2）得到累积释药率，以时间与累积释药率制作各药物的释药曲线.累积释药率按以下公式进行计算：

Qn为累积的释药率（%）；Cn为n次取样时样液中所含的药物浓度（μg/mL）；V为取样体积（4 mL）；V0为锥形瓶内溶液的总体积（50 mL），其中W是载药量.

以交联时间、CaCl2浓度以及不同模型药物等对微凝胶释药性能进行进一步考察.

2.内容：借助互联网吸纳电工作业的新方法、新技术、新工艺、新标准，充实培训内容；并通过信息技术增强培训的直观性和吸引力。

1.5.1 交联时间

按照1.2制备方法称取4组SA和HA于烧杯中，加入蒸馏水，搅拌溶解后往烧杯中加入ADH、EDC/NHS和0.1 g姜黄素，然后继续搅拌，控制交联时间为6、9、10和12 h.而后制备方法同1.2，最终得到不同交联时间的HA-SA复合载药微凝胶.由释药结果，得最佳交联时间.

1.5.2 CaCl2浓度

其他条件不变，CaCl2的浓度分别为2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%，上述同法制备5组微凝胶，然后进行释药实验.由释药结果，得出最佳交联CaCl2浓度.

1.5.3 不同载药复合微凝胶

称取3份0.4 g SA和0.2 g HA，其他条件不变，分别称取0.1 g的姜黄素、吲哚美辛和二甲双胍，制备3组不同的载药微凝胶，然后自然风干.制得的微凝胶进行释药，由释药结果得出微凝胶对不同药物的缓释效果.

2 结果与讨论

2.1 复合微凝胶的表征分析

2.1.1 复合水凝胶与复合微凝胶的形貌表征

由图3可知，新制的HA-SA复合水凝胶是白色的球状体，球体直径约为0.3 cm，风干后体积明显变小，直径约0.1 cm；而溶胀后的水凝胶变成了近透明的球体，体积比新制的水凝胶大.而制备的HA-SA复合微凝胶呈白色小球状，风干后偏粉末，体积明显变小；载姜黄素药物的HA-SA微凝胶呈现黄色，直径约为0.05 cm.

图3 HA-SA复合水凝胶及HA-SA复合微凝胶的形貌比较Fig.3 Comparison of morphology of HA-SA compositehydrogel and HA-SA compositemicrogel

2.1.2 复合微凝胶的FT-IR及XRD分析

由图4可知，HA-SA复合微凝胶的图谱保留了纯HA及SA的特征吸收峰，且HA-SA红外光谱中1680 cm-1处新增了酰胺键的吸收峰，由此可知，HA的-COOH与交联剂ADH的-NH2成功的进行了脱水缩合反应形成了酰胺键.

图4 HA-SA复合微凝胶红外光谱分析Fig.4 Infrared spectrum analysis of HA-SA compositemicrogel

从图5中可看出SA的衍射图在衍射角（2θ）约为14°左右处有尖锐的衍射峰，而HA的衍射图没有尖锐峰，该结果表示材料SA具有晶形结构，HA没有晶形结构.而以SA、HA为原料制备的HA-SA复合微凝胶也没有出现衍射峰，由此可知SA在经物理交联后结构变为不定型结构.

图5 HA-SA复合微凝胶X射线衍射图谱分析Fig.5 X-ray diffraction pattern analysisof HA-SA compositemicrogel

2.2 复合水凝胶溶胀性能分析

水凝胶的溶胀性能是影响是药物释放的重要因素.为此，首先考察了HA-SA宏观水凝胶的溶胀性能，以期进一步考察其微凝胶的释药行为.由图6可知，该复合水凝胶有明显的pH敏感性，前2 h于SGF中HA-SA复合水凝胶基本不溶胀，溶胀率在5以内，而当2 h后更换SIF，此后水凝胶网络结构逐渐打开，体积变大不断溶胀，约33.5 h后达到最大溶胀率44.故此水凝胶由pH=1.2的SGF转至pH=7.4的SIF中后，溶胀率发生明显变化，由SGF中几乎不溶胀到SIF中逐渐溶胀并最终达44的溶胀率，充分说明该凝胶体系具显著pH敏感性，可控制药物在肠道缓慢持续释放.

图6 HA-SA复合水凝胶的溶胀曲线Fig.6 Swellingcurveof HA-SA compositehydrogel

2.3 复合微凝胶释药性能分析

通过对复合微凝胶进行单因素考察，得到交联时间、CaCl2浓度以及不同模型药物等因素对该微凝胶释药性能的影响，结果见图7.

图7 制备条件对HA-SA复合微凝胶释药性能的影响Fig.7 Theinfluenceof preparation conditions on thedrugreleaseperformance of HA-SA compositemicrogels

2.3.1 交联时间

由图7（a）可知交联12 h所得微凝胶对pH变化最敏感，可更好地控制药物在肠道缓慢持久的释放，此时微凝胶具有较好的pH响应性.且交联12 h时，可达更好的交联度，使整个凝胶体系更加稳定.

2.3.2 CaCl2浓度

SA浓度不变（图7（b）），不同浓度的CaCl2溶液制备的微凝胶累积释药率大致相同，都可达包载量的90%以上，表明Ca2+不是影响微凝胶释药性能的关键因素，但比较而言2.5%CaCl2的缓释效果较好.

2.3.3 不同载药复合微凝胶

微凝胶对姜黄素有良好的缓释作用效果（图7（c））；而吲哚美辛微凝胶在前2 h就发生药物突释且平衡时只有约60%的释药量，药物释放不完全；二甲双胍微凝胶突释严重.相同的凝胶体系，由于二甲双胍极易溶于水，而溶解度大的药物释药较快［16］，且吲哚美辛较姜黄素也有较好的溶解性.因此，该微凝胶体系对姜黄素具有最好的缓释作用，可控制药物在肠道缓慢持久释放发挥治疗作用.

3 结语

以HA和SA为原料，制备了一种具有互穿网络结构的pH敏感型微凝胶，该体系反应条件温和，原料经济易得且制备简便.当溶胀时间为33.5 h时复合微凝胶溶胀率达44；当Ca2+浓度为2.5%，交联时间为12 h时，复合微凝胶有最佳释药性能；且该微凝胶对姜黄素的缓释效果要优于吲哚美辛和二甲双胍.HA-SA复合微凝胶不仅具有pH敏感性控制药物在肠道中的作用而且可以控制药物的缓慢持久释放，在药物递送和治疗肠道疾病领域上具有潜在价值.