AQC柱前衍生/UPLC－MS/MS测定蜂蜜中的内源性氨基酸和牛磺酸成分

卢兰香，郑 红，武传香，魏莉莉，丁 一，王 骏，祝建华，刘艳明，薛 霞

（山东省食品药品检验研究院 国家市场监管重点实验室（肉及肉制品监管技术），山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101）

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质［1－2］。其主要成分有葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等，还含有蛋白质、酚类物质、氨基酸、牛磺酸等多种微量成分［3］。蜂蜜兼具营养价值和药理作用，是不可多得的保健食品［4］。游离氨基酸是蜂蜜中一类重要的营养素，占蜂蜜总量的1%左右，包括蛋白质氨基酸以及非蛋白质氨基酸。牛磺酸结构与氨基酸类似，是天然牛黄的主要成分之一。牛磺酸的存在丰富了蜂蜜的营养成分，对蜂蜜的药理作用做了合理的解释［5］。

随着蜂蜜需求量的不断扩大，蜂蜜产业的特殊性导致蜂蜜产量供不应求，掺假现象严重。掺假的主要手段是向蜂蜜中添加与蜂蜜组分相近的外源性糖类，如玉米糖浆、麦芽糖浆、蔗糖糖浆等［6］。国内外报道了多种鉴别蜂蜜真伪的方法，但均不能从根本上解决蜂蜜掺假鉴别问题，还需要对蜂蜜中更多的特异性成分进行分析，以完善蜂蜜真伪鉴别技术。蜂蜜中游离氨基酸的种类和含量因花源、地域和气候的不同而有差异，可用于鉴别蜂蜜掺假、种类和产地［7］。食品安全国家标准GB/T 32946－2016［8］仅规定了脯氨酸的测定方法，对于蜂蜜真伪鉴别具有很大的局限性。此外，目前关于蜂蜜中氨基酸的研究多局限于某一种或几种特定氨基酸的测定或单花蜜。因此，建立蜂蜜中多种氨基酸和牛磺酸等内源性成分的分析方法，对于蜂蜜的营养价值评价、品质及掺伪鉴别至关重要。

目前，氨基酸和牛磺酸的检测方法主要有氨基酸分析仪［9－10］、高效液相色谱法［11－18］、液相色谱－串联质谱法［19－26］等。常规的氨基酸分析仪用途单一、灵活性差、普适性差、分析时间长。液相色谱法虽然普适性广，但存在一定的局限性，必须严格优化色谱条件，以确保所有组分完全分离才能准确定量。液相色谱－串联质谱法可以分离不同质荷比的共洗脱化合物，有效减少色谱运行时间，具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，更适于性质相近的多种目标化合物的检测。氨基酸和牛磺酸的检测技术主要有直接测定和间接分析两种。由于氨基酸与牛磺酸无发色基团，无法采用常规紫外或荧光检测器直接测定；且二者极性强、分子量小，其特征离子受基体干扰严重，亦不适合质谱检测器检测，因此常采用基于化学衍生化的色谱或质谱分析方法进行间接测定。通过化学衍生化法改变目标物的分子结构以及色谱与质谱特性，可提高方法灵敏度。常用的衍生化试剂有异硫氰酸苯酯（PITC）、邻苯二甲醛（OPA）、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）、茚三酮，但多数衍生化操作存在过程繁琐、稳定性差、副产物有干扰或毒性。AQC能与一级、二级氨基酸反应，生成稳定的衍生物脲，操作简单、副反应少，不受样品基质干扰，更适用于复杂基质样本中氨基酸及牛磺酸的分析。

本研究基于AQC衍生法，采用超高效液相色谱－串联质谱对蜂蜜中的内源性氨基酸和牛磺酸进行定性和定量分析，可为蜂蜜的质量控制提供依据，为蜂蜜营养价值和品质评价以及蜂蜜掺假鉴别提供新途径。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、组氨酸（His）、丝氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、蛋氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、谷氨酰胺（Gln）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；甘氨酸（Gly）购于中国计量科学研究院；羟脯氨酸（Hyp）、胱氨酸（Cys）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Cit）购于北京曼哈格生物科技有限公司；鸟氨酸（Orn）购于上海甄准生物科技有限公司；牛磺酸（Tau）购于美国Sigma－Aldrich公司；天冬酰胺（Asn）购于上海安谱实验科技股份有限公司；12种氨基酸混合标准溶液内标（甘氨酸－13C－15N浓度为2 500 μmol/L，其余均为500 μmol/L）购于Cambridge Isotope Laboratories Inc.公司。AccQFluorTM氨基酸衍生试剂盒（配有AccQ－Fluor硼酸盐缓冲液、AccQ－Fluor衍生剂）购于美国Waters公司。

实验用天然成熟蜂蜜均购自当地蜂农，其它蜂蜜和糖浆均购自当地超市或网络途径购买。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量标准物质，配制成10.0 mmol/L的标准储备液。取适量标准储备液，加入适量内标配制成系列浓度的混合标准工作溶液（0.1～200 μmol/L）。

1.3 样品前处理

提取：称取1 g（精确至0.000 1 g）蜂蜜样品置于15 mL离心管中，加入适量超纯水，涡旋混匀至溶解，超声提取10 min。将溶液转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至10 mL。充分摇匀，精确量取1 mL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用。

衍生：取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液与70 μL AccQ－Fluor硼酸盐缓冲液混合，加入20 μL AccQ－Fluor衍生剂涡旋混合后，置于55℃烘箱中加热10 min，冷却至室温后上机测定。

空白实验：除不加试样外，其余操作步骤与试样相同。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：AccQ－Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A为10 mmol/L甲酸铵溶液，B为乙腈；进样体积：1 μL；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～1.0 min，99%A；1.0～11.0 min，99%～92.5%A；11.0～15.0 min，92.5%～85%A；15.0～19.0 min，85%～77%A；19.0～19.01 min，77%～10% A；19.01～21.0 min，10% A；21.0～21.01 min，10%～99% A；21.01～23.0 min，99%A。

跳出禁养区：如果你的养殖场在禁养区内，且超出地方政府的规模养殖标准，与其等着受罚，不如主动配合进行搬迁，趁早离开，寻求新的发展。

1.4.2 质谱条件离子源：喷射流电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式（ESI+）；干燥气温度：250℃；干燥气流速：7 L/min；雾化气压力：310 275 Pa（45 psi）；鞘气温度：350℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：4 000 V；喷嘴电压：0 V；采集模式：多反应监测（MRM）。24种目标化合物及内标的质谱参数见表1。

表1 24种目标化合物及内标的质谱参数Table 1 Optimized parameters of MS/MS for 24 analytes and their internal standards

（续表1）

1.5 基质效应评价

通过在纯溶剂与样品中添加相同浓度的同位素内标，测定二者的峰面积响应值，评价基质效应（ME）。ME（%）=（A-B）/A×100［27］，其中ME为基质效应因子，A为纯溶剂中内标的峰面积响应值，B为样品提取液中内标的峰面积响应值。ME为0，表示无基质效应；其绝对值越大则基质效应越强；ME在-15%～15%之间，表示基质效应影响不明显。

1.6 数据处理

通过与仪器配套的Agilent MassHunter采集软件和Agilent MassHunter定量分析软件完成数据采集与处理，Origin 8.0进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择蜂蜜中大量的糖分、氨基酸、矿物质等易溶于水，水系溶剂能使样品均匀分散，有利于目标物的提取。文献多采用水和盐酸溶液提取食品中的氨基酸［25，28］，为不影响后续的衍生步骤，实验比较了水和0.1 mol/L HCl对蜂蜜中24种目标物提取效果的影响。结果表明，分别用水和0.1 mol/L HCl提取时，蜂蜜样品中24种目标物的含量、回收率和基质效应均无明显差异。基于操作简单和环保方面考虑，实验选择用水提取。

2.1.2 衍生试剂用量的选择由于衍生试剂用量直接影响分析结果的准确性和重复性，根据蜂蜜中氨基酸与牛磺酸的含量范围，实验采用24种目标物线性范围上限浓度的标准溶液，考察了不同体积的衍生试剂（5、10、20、30 μL）对24种目标物衍生物峰面积的影响（图1）。

图1 衍生试剂用量的影响Fig.1 The influence of derivation reagent dosage

实验表明，随着衍生试剂用量的增加，氨基酸和牛磺酸衍生物的峰面积逐渐增加，衍生试剂用量超过20 μL后峰面积趋于平稳；衍生试剂用量不足时，不同氨基酸的衍生效率不同。原因可能是不同氨基酸与衍生试剂的反应速度不同，衍生试剂不足时不同氨基酸之间存在竞争，导致衍生效率不同。另一方面，某些氨基酸存在2个氨基，衍生试剂不足时，只有1个氨基能衍生化生成单衍生化物质，衍生效率降低。当衍生试剂超过20 μL时，Asp和Glu的峰形较差。所以实验选择衍生试剂的用量为20 μL。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择实验考察了Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和AccQ－Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）两种色谱柱对24种目标物分离效果和基质效应的影响。结果表明，在Ultra C18色谱柱上，Ser与Asn、Tau与Cit、Ile与Lys不能达到基线分离；而在HSS T3色谱柱上，除上述化合物外，Cit、Tau及Thr，Arg与Ala也不能达到基线分离，Ultra C18色谱柱的分离效果更好。图2表明，12种有同位素内标的目标化合物在HSS T3色谱柱的基质效应明显高于Ultra C18。因此，实验选择Ultra C18色谱柱。

图2 不同色谱柱对目标化合物基质效应的影响Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the matrix effects of analytes

2.2.2 流动相的选择以10 mmol/L甲酸铵为水相，比较了乙腈与甲醇分别为有机相时对分离效果的影响。实验发现，甲醇作为有机相时对目标物的分离效果很差，因此实验选用乙腈为有机相。进一步比较了10 mmol/L甲酸铵（含0.01%甲酸）、10 mmol/L甲酸铵（含0.02%甲酸）、10 mmol/L甲酸铵（含0.05%甲酸）、10 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）、10 mmol/L甲酸铵对目标物分离效果、灵敏度和峰形的影响。结果表明，上述分离体系的分离效果和目标物峰形无明显差异，但随着甲酸比例的增加，氨基酸和牛磺酸衍生物的峰面积响应值逐渐降低，在乙腈-10 mmol/L甲酸铵体系中的峰面积响应值和灵敏度最高，所以实验选择乙腈-10 mmol/L甲酸铵作为流动相。

由于流动相浓度也是影响分离效果、灵敏度和峰形的重要因素，因此比较了甲酸铵溶液浓度（5、10、20 mmol/L）对24种目标物分离效果的影响。实验表明，甲酸铵溶液浓度为5 mmol/L时目标化合物的峰形差，甲酸铵溶液浓度为10 mmol/L和20 mmol/L时的分离效果、灵敏度和峰形几乎无差异。因此，选择甲酸铵溶液的浓度为10 mmol/L。

2.3 质谱条件的优化

在电喷雾正离子模式下，对500 μmol/L的各目标化合物标准溶液衍生后进行全扫描，得到每个目标化合物的分子离子及优化的离子源参数；然后对其分子离子进行二级质谱扫描，确定2个特征碎片离子，优化每对离子所需的电压和碰撞能，最后以多反应监测模式进行扫描，优化的质谱参数见表1。混合标准溶液（20 μmol/L）的总离子流图见图3。

图3 氨基酸与牛磺酸混合标准溶液（20 μmol/L）的总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of amino acids and taurine mixed standard solution（20 μmol/L）

2.4 基质效应

由于氨基酸和牛磺酸是蜂蜜中一类重要的营养素，属于蜂蜜的内源性物质，无空白样品，无法使用空白基质标准溶液的方法进行定量，所以实验采用同位素内标消除基质干扰，实现准确定量。在液相色谱－串联质谱中，同位素内标的引入是有效抵消基质影响，提高分析方法准确性及稳定性的最有效方法［27］。研究发现，本方法的ME为-15.0%～15.0%，表明基质效应影响较小。

2.5 方法学评价

2.5.1 线性范围、检出限与定量下限将“1.2”配制的系列混合标准工作溶液按“1.3”衍生后，按浓度由低到高的顺序依次经UPLC－MS/MS进行测定，以各目标化合物的浓度（X，μmol/L）为横坐标，各目标化合物的峰面积与其内标峰面积之比（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。24种目标物在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）均不小于0.993 0（见表2）。以信噪比S/N≥3得到目标化合物的检出限（LOD），以S/N≥10得到目标化合物的定量下限（LOQ）。如表2所示，24种目标物的LOD为0.03～0.15 μmol/L，LOQ为0.1～0.5 μmol/L，均远低于食品安全国家标准GB/T 32946－2016［8］和文献［28］报道的方法。本方法可满足上述氨基酸与牛磺酸定量分析的要求。

表2 24种目标化合物的线性关系、检出限、定量下限、回收率和相对标准偏差（n=6）Table 2 Linear relations，limits of detection，limits of quantitation，recoveries and relative standard deviations of 24 analytes（n=6）

2.5.2 回收率与相对标准偏差选取某洋槐蜂蜜进行回收实验。样品中低于检出限的目标化合物按LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ，已知含量的目标化合物按其含量的50%、100%、150%，分别添加低、中、高3个不同浓度的标准溶液，各水平平行测定6次。由表2可知，24种目标物在3个加标水平下的回收率为90.5%～109%，相对标准偏差（RSD）为1.2%～4.7%。本方法的准确度和精密度均满足实际样品分析要求。

2.6 实际样品的测定

利用本方法对39批次天然成熟的真蜂蜜（枣花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜各13批次）、39批次掺假蜂蜜（廉价蜂蜜中经检测确认较大概率为掺假蜂蜜的样品，枣花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜各13批次）、果葡糖浆、甜菜糖浆、麦芽糖浆、大米糖浆等10批次糖浆进行检测。结果表明：糖浆中24种目标物均未检出。不同种类的真、掺假蜂蜜检测结果见表3。不同蜜源蜂蜜中除Cit、Cys和Met均未检出外，其余目标化合物的组成及含量存在明显差异，这与蜜源植物花粉本身、地理环境、气候有关。不同种类的真蜂蜜中Pro和Phe的含量最高，且在荆条蜜和枣花蜜中的含量均高于洋槐蜂蜜。掺假蜂蜜中目标化合物的组成及含量与真蜂蜜存在明显差异，原因可能与蜂蜜中掺假糖浆的比例有关。

表3 不同蜂蜜中24种目标化合物的含量比较（n=3）Table 3 Comparison of the contents for 24 analytes in different honey samples（n=3） w/（mg·kg-1）

3 结论

本文基于AQC柱前衍生和UPLC－MS/MS技术，建立了蜂蜜中内源性氨基酸和牛磺酸成分的分析方法。样品经水提取，AQC衍生，采用同位素内标法定量以降低基质效应的影响，并利用质谱的高选择性，获得了稳定良好的测定结果。该方法操作简单、选择性好，结果准确可靠，灵敏度高，适用于蜂蜜中23种内源性氨基酸和牛磺酸的定性定量分析。利用该方法对实际蜂蜜样品进行检测，并将枣花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜及糖浆的测定结果进行了比较。本研究为蜂蜜的质量控制提供了技术支持，为蜂蜜营养价值和品质评价提供了依据，对于蜂蜜掺假鉴别和类别鉴定具有重要意义。