响应面法优化混合益生菌发酵银杏叶药渣工艺条件的研究

张惠捷，罗盟錡，王金龙，黄海东，陈帅君，吴 疆

（天津农学院，农学与资源环境学院，天津 300392）

银杏（Ginkgo bilobaL.）属银杏科、银杏属植物，是我国独有的树种之一；银杏叶是它的干燥叶，性平、味甘、苦、涩等，主要成分是黄酮类、萜烯内酯类化合物（杨芳等，2018）；具有活血化瘀、平喘、降脂的功效，除此之外银杏叶中的黄酮还具有抗炎症、抗酶活性等效用（宋立立等，2020；丁立好等，2019）；银杏叶中的黄酮可作为绿色环保的添加剂添加在饲料生产中，银杏叶渣是银杏叶提取物（EGB）提取后剩下的残渣，每年我国产生数万吨的银杏叶渣，其中大量的成分还未被充分利用，此时若直接加入饲料中进行生产，一方面动物无法进行吸收利用，另一方面其中还残留着银杏酸等有毒物质，会造成一些难以预料的影响；近年来，微生物发酵饲料成为新的研究热点，微生物可以降解银杏叶中的细胞壁，释放出其中还未被充分利用的物质，还能对银杏酸等有毒物质进行降解，达到减毒的目的，提高对银杏叶药渣的综合利用率（周昊等，2014）。本研究以银杏叶药渣为原料，以黄酮含量的变化率、银杏酸的降解率为指标，对其发酵条件进行优化，为提升银杏叶中物质的综合利用率提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 银杏叶：市售银杏叶；混合益生菌冻干粉：安徽仁微保健品有限公司，内含动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌，活菌数为3×1012个/g；MRS液体培养基。

1.2 试验仪器UV-2100紫外可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公式；HNY-2102恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；LDZX-30FBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；AR124CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；MJ-WBL2501A粉碎搅拌机：美的集团。

1.3 混合益生菌发酵银杏叶药渣工艺流程 市售银杏叶→挑选→烘干→粉碎→煮沸，弃药液→烘干→混合MRS培养基→高温灭菌→接种混合益生菌→恒温摇床发酵→成品→分析测定。

银杏叶药渣+MRS液体培养基，121℃，灭菌20 min，27℃冷却。在发酵液中加入复合益生菌冻干粉剂，混匀后取1 mL上清，测定其菌量、黄酮含量、银杏酸含量。置于摇床培养（150 r/min、38℃），发酵后，混匀后取1 mL上清，测定其菌量、黄酮含量、银杏酸含量。以黄酮含量变化率（加入复合益生菌冻干粉发酵后黄酮的含量/未加入复合益生菌冻干粉前黄酮的含量，下同）、银杏酸降解率（未加入复合益生菌冻干粉前银杏酸的含量-加入复合益生菌冻干粉发酵后银杏酸的含量/未加入复合益生菌冻干粉前银杏酸的含量，下同）、菌量变化率（加入复合益生菌冻干粉发酵前的菌液中菌量/加入复合益生菌冻干粉发酵后的菌液中菌量，下同）为指标，对发酵条件进行优化。

1.4 标准曲线的绘制

1.4.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法绘制黄酮标准曲线 参考李仁杰等（2019）方法，选取六只25 mL的玻璃具塞刻度试管，用标签纸将其从1到6按顺序编码。按编号顺序准确取用芦丁标准品（0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL）。再精密量取70%乙醇使得每管体积皆是1 mL。用移液管准确取用1 mL 5%亚硝酸钠，静置等待其充分反应6 min。准确取用1 mL 10%硝酸铝，静置等待其充分反应6 min。分别加入10 mL 4%氢氧化钠。用乙醇稀释到25 mL刻度位置，摇晃试管，静置等待其充分反应15 min。在510 nm的波长下依次检测吸光度，收集并整理数据。将芦丁浓度作x轴，在波长510 nm条件下测得的吸光度值作y轴，制备标准曲线，获得回归直线方程为：y=0.9809x-0.0008，R2=0.9985。

1.4.2 黄酮的测定方法 黄酮的最大吸收峰位于510 nm处，采取紫外分光光度法在最大吸收峰处测定吸光度，具体参考肖珊美等（2020）方法。

1.4.3 银杏酸标准曲线的绘制 银杏酸的最大吸收波长为307 nm，采取紫外分光光度法，在307 nm处测定其吸光度，选取六只25 mL的玻璃具塞刻度试管，用标签纸将其从1到6按顺序编码。按编号顺序称取一定量的银杏酸并成倍增加，再用无水甲醇精确定容至25 mL刻度线。配制成系列梯度浓度的银杏酸标液，在307 nm的波长下依次检测吸光度，收集并整理数据。将银杏酸浓度作x轴，在波长307 nm的前提条件下测得的吸光度值作y轴，制备标准曲线，获得回归直线方程为：y=8.6451x+0.0449，R2=0.9995。

图2 银杏酸浓度标准曲线

1.4.4 银杏酸的测定方法 银杏酸的最大吸收峰位于307 nm处，采取紫外分光光度法在最大吸收峰处测定吸光度，具体见秦俊哲等（2012）方法。

1.5 银杏叶发酵条件的筛选

1.5.1 单因素发酵试验 采取单因素试验，以发酵产物中的黄酮含量变化率、银杏酸降解率和菌液中菌量的变化率为主要参考对象，对料液比（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL）、接种量（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 g/mL）、发 酵 时 间（9、12、15、18、21、24 h）三个发酵条件进行筛选，依次改变银杏叶药渣与MRS液体培养基的料液比（m银杏叶：V培养基=g/mL）、混合益生菌冻干粉接种量（m冻干粉/V培养基=g/mL）、发酵时间（h）进行单因素试验，考察发酵对黄酮含量、银杏酸含量变化的影响，以黄酮升高、银杏酸降低、菌量稳定为优先原则，筛选出符合这三个因素的发酵条件。

1.5.2 料液比的确定 在250 mL的三角瓶中装入混合好的银杏叶药渣，选取接种量为3%，发酵时间为24 h，依次改变银杏叶药渣与MRS培养基的料液比（m银杏叶：V培养基=0.05、0.10、0.15、0.20），在38℃，发酵时间24 h，摇床转速150 r/min，测定其菌量、黄酮及银杏酸的含量。

1.5.3 接种量的确定 在料液比确定情况下，选取发酵时间为24 h，在250 mL的三角瓶中装入混合好的银杏叶药渣，依次改变培养基接种量（m冻干粉/V培养基=1%、2%、3%、4%、5%），在38℃，发酵时间24 h，摇床转速150 r/min，测定其菌量、黄酮及银杏酸的含量。

1.5.4 发酵时间的确定 在上述料液比、接种量确定的情况下，在250 mL的三角瓶中装入混合好的银杏叶药渣，依次改变培养基发酵时间（9、12、15、18、21、24 h），在38℃，摇床转速150 r/min，测定其菌量、黄酮及银杏酸的含量。

1.6 混合益生菌发酵银杏叶药渣的响应面优化试验 在单因素试验结果基础上，选取料液比（A）、接种量（B）、发酵时间（C）三个因素的水平值，以发酵前后银杏酸降解率（R1）、黄酮含量变化率（R2）为考察因素，用Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert 12.0工具，对响应面进行设计，每组试验重复三次，响应面试验因素与水平如表1。

表1 混合益生菌发酵银杏叶渣响应面试验因素与水平

2 结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对黄酮、菌液、银杏酸含量变化的影响 由图3、图4可看出，随着料液比的升高，发酵过程中菌量变化呈现先增后减的趋势，进而影响银杏叶发酵前后的银杏酸降解率和黄酮的含量变化，使之也呈现先升后降的趋势，当料液比为0.1、0.15时，银杏叶药渣发酵中菌量变化、银杏酸降解率和黄酮含量变化率较高，且变化差异不大，此时的黄酮含量与银杏酸降解率处于较高水平，由此可以看出，混合益生菌的生长繁殖与料液比变化紧密相关，从而影响两个指标的变化，料液比过低时，含水量较少，此时混合培养基较为黏稠，不利于混合益生菌的生长，也不利于混合益生菌对其中成分的利用、对其他成分的降解发酵；当料液比过高时，此时含水量较高，则可能导致其中的有效营养物质浓度相对较低，不足以提供此时混合益生菌的充分生长，降低了混合益生菌的生长速率；因此，在适宜的料液比条件下，混合益生菌生长状态良好，发酵才能彻底。由此，选取0.06、0.13、0.20作为下一步优化的条件。

图3 料液比对银杏叶发酵中菌量变化和银杏酸降解率的影响

图4 料液比对银杏叶发酵中菌量变化和黄酮含量变化率的影响

2.1.2 接种量对黄酮、菌液、银杏酸含量变化的影响 由图5、图6可看出，随着接种量的升高，发酵过程中菌量变化和黄酮含量变化以及银杏酸降解率均呈先升后降的趋势，当接种量处于1.5%的条件下，黄酮含量、菌量变化、银杏酸降解率处于较低水平，这是因为最初时刻的接种量过低，发酵时间长，混合益生菌增长缓慢；当接种量处于5%的条件下，三角瓶中的营养物质含量有限，混合益生菌数量先增多，而后受到抑制，其次发酵产物迅速积累，发酵产物银杏酸等有毒物质来不及降解而发生堆积现象，可能抑制菌量增长，影响发酵中混合益生菌的数量，从而影响发酵中的黄酮含量变化以及降低银杏酸降解率。因此，选取接种量为2%、3.5%、5%进行下一步优化。

图5 接种量对银杏叶发酵中菌量变化和银杏酸降解率的影响

图6 接种量对银杏叶发酵中菌量变化和黄酮含量变化率的影响

2.1.3 发酵时间对黄酮、菌液、银杏酸含量变化的影响 由图7、图8可知，随着发酵时间的延长，银杏叶药渣发酵中的菌量变化和黄酮含量变化、银杏酸降解率也呈现先升后平缓再降低趋势。在发酵15 h前，发酵时间短，混合益生菌最佳活力未被激活，而导致发酵不完全，银杏叶药渣中的物质未被充分发酵分解，各项指标呈现增长趋势；在发酵15 h后，混合益生菌菌量、黄酮含量、银杏酸降解率达到最大；发酵时间在15～18 h时，指标达到稳定；在发酵18 h后，银杏叶药渣发酵中的菌量变化和黄酮含量变化、银杏酸降解率开始呈现降低趋势，随着时间的增长，菌量受到发酵中成分的影响，达到最大值，发酵过程产生大量未降解的产物及银杏酸等有毒物质，抑制益生菌群的生长，导致益生菌菌株生长受到限制，进而影响银杏酸降解率、黄酮含量变化。因此，选12、15、18 h进行下一步的优化。2.2响应面优化试验结果 在单因素结果基础上，利用Box-Behnken试验原理设计，以料液比（A）、接种量（B）和发酵时间（C）为自变量，以银杏酸降解率和黄酮含量变化率为响应值，进行相对应的的响应面试验设计（表2）。

图7 发酵时间对银杏叶发酵中菌量变化和以银杏酸降解率的影响

图8 发酵时间对银杏叶发酵中菌量变化和黄酮含量变化率的影响

表2 响应面试验原理设计方案及结果

2.2.1 回归方程及方差分析 以黄酮含量变化率为响应值，分析见表3，处理后，得到回归方程：Y1（黄酮含量变化率）=1.42+0.0675A-0.0112B+0.0263C-0.0075AB-0.0425AC-0.0050BC-0.0865A2-0.1690B2-0.0340C2。该回归方程模型（P＜0.05，下同）显著，失拟项不显著（P＜0.05，下同），说明没有产生失拟现象；R2为0.8774，表明在银杏叶药渣发酵过程中以黄酮含量变化率建立的模型与实际结果差异较小，拟合程度较高。调整系数R2为0.7198，说明该模型有71.98%响应值的变化可以解释，可用于预测黄酮含量变化率的理论值。一次项A和二次项A2对银杏叶药渣发酵中的黄酮含量变化率有显著影响（P＜0.05，下同），平方项B2对银杏叶药渣发酵中的黄酮含量变化率有极显著影响（P＜0.01，下同），而一次项B、C和交互项以及平方项AB、AC、BC、C2对黄酮含量变化率影响不显著。根据F值大小可知，各因素对银杏叶药渣发酵黄酮含量变化率的影响的排序为A＞C＞B，即料液比＞发酵时间＞接种量（陆冉冉等，2020）。

表3 以黄酮含量变化率为响应值方差分析

以银杏酸降解率为响应值，分析见表4，处理后，得到回归方程：Y2（银杏酸降解率）=0.3469+0.0060A+0.0300B-0.0071C-0.0220AB+0.0016AC+0.0104BC-0.0505A2-0.0288B2-0.0516C2（刘其星等，2021）。该回归方程模型显著，失拟项不显著，说明没有产生失拟；R2为0.8826，表明在发酵过程中以银杏酸降解率建立的模型与实际结果差异较小，拟合程度较高。调整系数R2为0.7316，说明该模型有73.16%响应值的变化可以解释，可用于预测银杏酸降解率的理论值。 一次项B对发酵中的银杏酸降解率有显著影响，二次项A2、C2对发酵中的银杏酸降解率有极显著影响，而一次项A、C和二次项以及平方项AB、AC、BC、B2对银杏酸降解率影响不显著。根据F值大小可知，各因素对发酵中银杏酸降解率的影响的排序为B＞C＞A，即接种量＞发酵时间＞料液比（陆冉冉等，2020）。

表4 以银杏酸降解率为响应值的方差分析

2.2.2 响应面图结果分析 由图9、10、11可知，料液比与接种量对黄酮含量变化率、接种量与发酵时间对银杏酸含量变化率、料液比与发酵时间对银杏酸降解率之间都对混合益生菌发酵银杏叶药渣中黄酮含量变化率、银杏酸降解率存在一定的交互作用影响，最佳预测点在试验范围内，该模型的拟合度较高，可以较准确的描述料液比、混合益生菌接种量、发酵时间与试验结论之间的关系。韩瑨等（2017）提出响应面曲线变化幅度越大，对于操作条件的改变影响就越大。由图10可见，三维图表面最陡峭，可知A（接种量）与C（发酵时间）的交互作用对银杏酸降解率影响最大。

图1 芦丁浓度标准曲线

图9 料液比与接种量交互对黄酮含量变化率影响的响应面图

图10 接种量与发酵时间交互对银杏酸降解率影响的响应面图

2.2.3 验证试验结果 利用Design-Expert 12.0软件预测混合益生菌发酵银杏叶药渣中黄酮含量变化率、银杏酸降解率的最佳发酵工艺条件，经过分析，其最佳条件为料液比0.13 g/mL、接种量3.5%、发酵时间15 h，此时的银杏叶药渣发酵中银杏酸降解率为34.69%，黄酮含量变化率为1.418。为验证响应面回归模型理论值的可行性，在料液比0.13 g/mL，接种量3.5%，发酵时间15 h条件下，进行平行试验三次，发酵后相对于发酵前的黄酮含量变化率为1.407，银杏酸含量降解了35.03%，与预测值相对误差较小，说明通过响应面优化试验得到的模型，具有一定的参考性，可以较为准确的反映出银杏叶药渣在混合益生菌发酵条件下中的黄酮含量变化率和银杏酸降解率。

图11 料液比与发酵时间交互对银杏酸降解率影响的响应面图

3 讨论

目前，银杏叶中黄酮的提取以及银杏酸的降解工艺大多通过正交试验进行优化，但目前仍存在发酵时间过长、黄酮得率较低、银杏酸降解难等一系列问题。因此，研究一种回收率高，同时可以将银杏叶药渣中的可利用成分尽可能保存并且降低其中的银杏酸等毒性成分含量的工艺逐渐成为现在的研究热点。益生菌微生物发酵是近些年的研究热点，利用一些具有安全性、益生作用的微生物发酵，不仅可以确保发酵过程的安全可靠，而且还有可能产生一些具有益生作用的物质。在本试验中，通过响应面试验模型，研究银杏叶药渣中料液比、接种量、发酵时间对黄酮含量变化率、银杏酸降解率的影响；在单因素发酵时间影响的试验中，银杏酸降解率与李银亮等（2013）研究的变化趋势大体相似，可能是由于发酵前期银杏酸含量较少，菌种活力较强，分解效率较高，随着发酵时间的增加，银杏黄酮的释放伴随着银杏酸的析出，菌种效率指数逐渐达到最大值，此后银杏酸开始堆积，银杏酸的大量堆积可能会抑制菌种活力，从而银杏酸降解率指标开始缓慢减少；通过响应面试验模型，得到本试验的最优条件为：料液比0.13 g/mL、接种量3.5%、发酵时间15 h，在此优化条件下，得到发酵过程中的黄酮含量变化率为140.7%，银杏酸含量降解率35.03%，该值与理论值基本吻合，说明响应面优化得到的发酵工艺参数，具有一定的可行性。在解文利等（2020）的研究中，采用紫红曲霉双向发酵，通过正交试验优化，在得到的最优条件下，总黄酮含量达到0.074 mg/mL，在本试验中最优条件下，黄酮含量变化率为140.7%，最终得到的总黄酮含量为0.1790 mg/mL，效果较优，可能是由于发酵菌种为混合菌，种类繁多，混菌中存在着分解能力较好的菌种，从而使得对银杏叶药渣中未被充分利用的物质释放出来，提高了黄酮含量，除此之外，本试验黄酮含量提高了40.7%，也高于Qiu等（2014）研究中用漆酶发酵提升了24.11%；在任金玫等（2015）的研究中，发酵15 d后，有毒成分银杏酸降解了44.6%，有效成分黄酮含量变化率为103.14%，本试验的银杏酸降解率与其基本一致，但黄酮含量变化率低，且发酵时间明显长于本试验，除此之外，该方法采用冠突散囊菌，只能用于生产，而不可食用，相比之下，本试验发酵时间短，且所选菌种为益生菌，可食用，安全性较高。

由此可证明此法，可以大幅降低银杏叶中有毒成分的比例，银杏叶药渣发酵物可以作为添加剂添加在蛋白饲料生产中，一方面提高了饲料中黄酮的含量，另一方面降低了银杏酸等有毒成分的比例，为蛋白饲料的生产提供了有效的保障（郑言等，2021）；除此之外，冉景盛等（2018）也将从银杏叶中提取到的黄酮作为添加剂，添加到发酵乳饮料中，为银杏叶发酵产物提供了新的应用方向；另外据相关医学研究证明，银杏叶黄酮还具有抗炎症、抗酶活性等多种效用，它还可以用作药品的生产研发（2021）；除此之外，银杏叶中的黄酮具有抗炎症的功能，并且具有天然性、无毒害、无耐药性等特点，在饲料生产中，可作为添加剂代替在饲料生产中大量使用的抗生素，但目前在这方面的研究仍处于试验探索阶段，需要在使用方法上进行进一步的科学研究探索。

4 结论

单因素试验和响应面试验双优化得到发酵条件为料液比0.13 g/mL、接种量3.5 g/mL、发酵时间15 h，在该条件下发酵后的黄酮含量变化率以及银杏酸降解率与预测值相对误差较小，基本一致，验证了该模型的可靠性，为银杏叶药渣发酵开发利用提供了有效的参考。