猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型与弓形虫混合感染的诊断与预防

吴晓晓，万新军，俞进，段真真，贾毅飞，何宗霖

（1.阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆 阿克苏 843000；2.阿克苏地区畜牧技术推广中心，新疆 阿克苏 843000）

猪肉肉质鲜美、营养丰富，是日常生活中最为常见且重要的优质肉源。发展养猪业不仅能有效保障肉食品的供应，也可为农民提供一条致富增收的途径，从而推动乡村振兴发展。目前，养猪业已成为了我国农村经济的一大支柱产业，也是我国农业发展不可或缺的一部分。近些年，我国养猪业由原来传统的散养模式逐渐向规模化、集约化的现代养殖模式转变与发展，生猪的生产性能得到了快速的提高，但生猪疫病的种类及暴发频率也逐渐增加，疫病混合感染已成为规模化猪场疫病防控的一大难题。猪繁殖与呼吸综合征是一种急性高接触性传染病，具有很高的发病率和死亡率，是生猪养殖中最为常见的疾病。猪圆环病毒病是一种免疫抑制性传染病，主要损害生猪免疫系统，造成其生产性能下降，易引发仔猪死亡，通常与猪呼吸与繁殖综合征混合感染，两种病原体在生猪体内能相互促进复制，从而降低了生猪的抗病能力，出现诱发继发性感染，如感染弓形虫病、口蹄疫及猪流感等疫病，最终加大治愈难度和诱发更高的死亡率，给养猪场造成极大的危害。

1 流行病学

1.1 病原体

猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是一种单股正链RNA病毒，其基因组大小约为15 kb，有囊膜；病毒粒子呈圆形，直径大小为50~60 nm；核衣壳的结构为对称的20面体，直径为25~30 nm[1]。该病毒分为欧洲型和美洲型，两种基因的同源性不超过60%，而氨基酸同源性78%~81%，在我国主要流行的是美洲型。该病毒对高温较为敏感，56℃条件下加热45 min便会完全失活，室温及37℃以下均不能存活；该病毒最适生存pH值为5~7，其感染力最强[2]。另外，该病毒对常见的消毒剂敏感，低剂量的乙醚和氯仿便可将其杀死消灭。

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种是单股负链DNA病毒，基因组大小为1 758~2 001 bp，无囊膜；病毒粒子呈圆形，直径为14~25 nm，核衣壳结构为20面体，是已知的最小动物病毒之一[3]。该病毒具有4种基因型，猪圆环病毒2型为其中致病性最强的类型，于19世纪90年代末在南美洲发现。该病毒可在猪肾细胞、猪睾丸细胞和猪肺泡巨噬细胞中增殖，损害生猪的免疫系统，通常会引起仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统疾病综合征及繁殖障碍性疾病[3]。该病毒对外界环境具有较强的抵抗力，对乙醚和氯仿的敏感性较低，常见的消毒剂不易将其杀死。

弓形虫属于球虫纲球虫目孢子虫科，体长4~10 μm，是一种广泛寄生在人和动物体内有核细胞内的寄生性原虫。弓形虫的生殖包含有性生殖和无性生殖，其生活史包括5个阶段，第一阶段为滋养体期，滋养体在有核细胞内快速分裂并占据宿主的细胞浆，形成假包囊；第二阶段为缓殖子期，弓形虫在囊壁内缓慢增殖形成包囊；第三阶段为裂殖体期，缓殖子在动物的小肠上皮细胞内裂体增殖，形成裂殖子；第四阶段为配子体期，配子受精形成合子，发育成卵囊；第五阶段为子孢子期，卵囊内的孢子体发育繁殖，形成2个孢子囊，每个孢子囊分化成4个子孢子。处于不同的发育阶段，呈现不同的形态，其滋养体和包囊均可使中间宿主和终末宿主感染发病[4]。

1.2 传播途径

猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病主要通过消化道和呼吸道进行传播。病猪和带毒猪为直接传染源，其排出的粪便、尿液及唾液等分泌物中含有大量的病毒，健康猪只通过接触污染的饲料、饮用水、饲养工具、垫草及空气均会感染。同时，该病毒还可通过受精及胎盘进行传播。此外，该病毒还可以通过蚊虫、苍蝇、蜱虫等进行传播。弓形虫病主要是由于生猪食入含有虫体的饲料或者饮用了含有生肉屑的泔水而发生感染。

1.3 流行特点

任何品种、任何年龄及任何性别的猪均可感染猪繁殖与呼吸综合征病毒，1月龄的仔猪及妊娠母猪感染率最高；该病呈地方流行性，往往急性发病，没有明显的季节性，但在蚊蝇滋生的季节发病率会更高。猪圆环病毒病各品种和各年龄的生猪均会感染，且6~12周龄的生猪最易感染；该病全年均会发生，但多发于夏季及秋季。猪弓形虫病任何品种和年龄的生猪均会感染，其中3~6周龄的仔猪和妊娠母猪发病率最高，而成年猪多呈隐形感染；该病主要发生在夏秋季节。通常情况下以上3种病原体均不易侵入生猪机体，但如果饲养管理不当、环境卫生较差、断奶应激或天气骤变就会引发感染。

2 临床症状

感染猪繁殖与呼吸综合征的病猪主要表现为精神萎靡，食欲减退，发热，咳嗽气喘，呼吸困难。妊娠母猪出现体温升高，食欲下降，精神不振，呼吸困难，流产、早产或产下死胎、弱胎，产后无乳，胎衣不下，以及产道分泌物增多，以后发情不正常，甚至出现繁殖障碍；产下的仔猪孱弱、发热、呼吸困难、腹泻严重，死亡率高达80%，而耐过仔猪多数会成为僵猪；种公猪配种能力下降，精子带毒，且其数量减少、质量下降，甚至出现畸形；育肥猪出现共济失调，站立不稳，被毛粗乱，其耳部、尾部及腹部的皮肤发绀，有的会出现结膜炎。

感染猪圆环病毒2型的病猪主要表现为食欲不振，精神萎靡，嗜睡，吻突干燥，流涕咳嗽，持续腹泻，机体消瘦，四肢呈暗红色，出现“接地红”现象。

感染弓形虫病的病猪主要表现为体温升高至41℃以上，典型的腹式呼吸，呼吸急促，采食量下降，被毛杂乱无光泽，皮肤呈紫红色的斑点或者红色小点，鼻腔流出泡沫样鼻涕，排出带血粪便，后躯无力，卧地不起。

以上3种疫病混合感染后主要表现为精神不振，厌食至食欲废绝，发热，腹式呼吸且呼吸困难，咳嗽气喘，嗜睡，被毛粗乱，四肢无力，站立不稳，流产，早产或产死胎、弱胎，繁殖功能下降，耳部、尾部及四肢皮肤呈紫红色发绀，腹部出现红斑，混合感染会增加治疗难度，死亡率可高达85%~100%。

3 实验室诊断

目前，猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型病毒和弓形虫常采用血清学诊断方法和分子生物学诊断方法进行确诊，其中血清学诊断方法主要包括免疫过氧化物酶单层试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。

免疫过氧化物酶单层试验的原理是通过将抗原吸附在固相载体上，加入被检样品形成抗原抗体的复合物，然后再加入酶标记的抗抗体，底物参与下显色，并通过显微镜判断结果。该方法的操作步骤如下：首先在无菌条件下采集病猪的血液，分离获得血清，保证血清透明无污染不溶血，将血清依次按四倍比例稀释，做好对照，然后分别取稀释血清各50 μL加入固定诊断板中，封板，37℃孵育1 h后倒去板中液体，用洗板液清洗3次，每次清洗1~3 min，之后倒置吸附纸上吸干水分；随后每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗抗体50 μL，封板后37℃放置感作1 h；倒去板中液体，按上述的洗涤方法清洗3次，吸干水分；每孔再加入氨乙基咔唑50 μL，封板避光放置18~24℃条件下感作30 min，显微镜下观察，若孔内30%~50%的细胞间质为深红色，则说明感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒。该方法存在一定的主观性，有时也会出现假阴性，不是特别适合大规模的检测应用。

间接免疫荧光试验的原理是通过将抗原吸附在固相上，加入被检细胞孵育结合形成抗原抗体复合物，再加入偶联有荧光素分子的抗抗体，与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察。具体操作步骤如下：无菌条件下采集病猪血液，分离血清，稀释，加入固定板中，加入配好的固定液，室温孵育10 min，弃液，用磷酸缓冲液清洗2次，每次5 min，再添加封闭液37℃静置1 h；再用磷酸缓冲液清洗2次，每次5 min，用滤纸吸取多余的水分，随后加入荧光标记的兔抗猪抗体溶液，使其完全覆盖样本，放置搪瓷盒中37℃保温处理30 min；再用磷酸缓冲液清洗2次，每次5 min，吸去多余水分，但样本保持一定的湿度，滴入甘油，放置荧光显微镜下观察荧光强度，根据荧光强度判断阳性。该方法需要专业的检测人员，且检测时间相对较长，但具有较好的特异性和敏感性，目前在临床上也较为常用。

酶联免疫吸附试验的原理是通过用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原的待测样品，如待检样品中有相应抗原存在即可与包被在固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为预测抗原的量。具体步骤如下：首先无菌条件下采集病猪血液，分离血清，4℃保存待检；再用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度，每孔加入200 μL，4℃过夜；再用磷酸缓冲液洗涤3次，每次5 min，去除包被液，抛干；随后取病猪血清，稀释，加至孔中，37℃孵育1 h；再用含有吐温的磷酸缓冲液洗涤3次，每次5 min，抛干；随后加入200 μL酶标抗体，37℃作用1~2 h（具体时间需要通过预试验确定）；再用含有吐温的磷酸缓冲液洗涤3次，每次5 min，抛干；加入200 μL底物溶液，室温作用30 min，再加入2 mol·L-1柠檬酸50 μL以终止反应；最后用分光光度计测定OD值。该方法的灵敏性和特异性高，操作简单且快速，不要求特殊设备，成本较低，适合大范围大批量的样品检测，是目前使用最为广泛的方法之一。

分子生物学诊断方法是通过PCR手段进行检测，主要包括RT-PCR和实时荧光定量PCR（qPCR）。RT-PCR具体操作步骤如下：首先根据Gen-Bank中公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型病毒和弓形虫的开放阅读框基因序列设计引物，然后根据相应的DNA提取试剂盒提取总RNA，随后构建RT-PCR反应体系，50℃逆转录30 min，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，再取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增目的片段，得到相应片段说明感染该病原体。qPCR是在RT-PCR的基础上，通过增加荧光探针，建立标准曲线可确定病毒感染量的大小。具体步骤如下：首先引物的设计和总RNA的提取过程和RT-PCR是一致的；然后根据相应试剂盒构建qPCR反应体系，并构建标准曲线，反应条件：42℃反转录5 min，95℃预变性10 s；95℃退火5 s，60℃延伸35 s，40个循环。以C值≤35并出现特定的扩增曲线判定为阳性。与其他方法比，该方法具有检测组织多样化、检测速度快、灵敏度和特异性最高等特点，同时还能区分高致病毒株和野生型毒株，也是目前使用最为广泛的方法之一。

此外，弓形虫的诊断还可以通过姬姆萨染色法。取病死猪肺部组织或淋巴结进行涂片，通过姬姆萨染色，可观察滋养体的形状多样，呈半月形、梨形或梭形，其一端略钝，一端略尖，其核处于中央或者略微偏向钝端，且被染成深蓝色，则可确定感染弓形虫[4]。该方法操作简单，成本低廉，非常适合检测急性弓形虫的感染；但该方法对检测人员的专业要求较高，且发病猪如果采取了药物治疗，其体内的弓形虫数量会减少，可能会对检测结果具有一定的影响。

4 预防措施

第一，重视猪舍消毒及卫生管理工作；及时清理栏舍粪污，定期对栏舍内外和饲养工具进行彻底的清洗及消毒，并做好防虫鼠、飞鸟措施，避免虫鼠滋生及随意出入栏舍；同时栏舍需全封闭式管理，禁止外来人员及车辆进出。第二，提供干燥、舒适的饲养环境；定期检修水电气设备，保障适宜的温度、湿度，控制饲养密度，保证通风效果良好。第三，均衡营养，合理饲喂；做好饲料管理，合理搭配饲料，定时定点饲喂，提供干净、充足的饮水。第四，强化检疫工作，及时进行疫苗免疫；养殖过程中需实时监测猪群健康动态并做好记录，根据当地疫病流行特点及时制定并实施疫苗免疫，另外，对病猪及时隔离处理，必要时扑杀并无害化处理。