提高发酵猫爪草多糖产量的菌种筛选

刘 涛，王 瑞，陈富生

(信阳农林学院，河南 信阳 464000)

0 引言

猫爪草原为无名野草，药用历史较短，是20世纪50 年代于河南省信阳地区发现的一种草药，后经信阳中医院依据其根形及能治疗鼠疮的特点定名为猫爪草。猫爪草味甘、辛，性平，具有解毒、化痰、消肿的功效。临床上用于治疗淋巴结结核、肺结核、骨结核、咽炎、疟疾和癌肿。河南省信阳地区是猫爪草的优势产区，其多糖含量优于其他产区。多糖具有的调节免疫作用，在养殖业替抗禁抗的大背景下，具有良好的开发前景。

据不完全统计，我国人药与兽药市场上，每年多糖的需求量在百万至千万吨以上。多糖资源的90%是从生药中提取[1]，但是中药药材多糖的成分含量有限，常规提取法得率也较低。由于微生物在代谢过程中能产生多种酶，使由纤维素、半纤维素等构成的细胞壁发生裂解，从而促进中药有效成分的释放，甚至产生新的活性物质，引起中药药性、药效等发生改变。菌种是中药微生物转化的关键和基础，目前中药微生物转化大部分是采用单一菌种进行发酵转化[2]。本试验通过比较粪链球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌4种益生菌对猫爪草发酵后的总多糖含量，为后期开发益生菌发酵中药工艺提供依据。

1 材料

猫爪草(信阳淮滨中药材市场，3年生中药材)；粪链球菌(南京牧丰生物科技有限公司)，枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌 (河南君安生物科技有限公司)。试剂：无水葡萄糖标准品、甘露糖标准品、乙醇、硫酸、蒽酮、蒸馏水、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠。

2 方法

2.1 猫爪草发酵工艺

发酵剂的制备： 0.5 g菌种溶于30 mL培养液(含2%葡萄糖，1%蛋白胨和0.5%氯化钠)，37℃下培养6～8 h。发酵：将发酵剂倒入装有中药的密封袋，充分搅拌均匀，密封后，37℃恒温培养5～7 d。100 g中药(中药用60～80目粉碎)对应0.5 g菌种。

2.2 水分、浸出物含量的测定

水分测定:称取过2号筛的发酵猫爪草药材粉末2 g，放置在干燥为恒重的称量瓶中，打开称量瓶盖后，在100℃～105℃下干燥5 h，后盖紧瓶盖转移至干燥器中冷却30 min，精密称定，放至烘干箱中在100℃～105℃下干燥1 h，干燥器中冷却30 min后称重，干燥至2次称重的误差以不超过5 mg为准。然后根据样品中损失的重量，计算样品中的水分含量。

冷浸法：称取过2号筛的发酵猫爪草药材粉末4 g，精密称定后放置于250～300 mL的锥形瓶中，加入蒸馏水100 mL，塞紧瓶盖，振摇6 min后静置18 h，用滤纸过滤，取滤液20 mL，放置在干燥为恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，放于烘干箱中在105℃下干燥3 h，取出后移至干燥器中冷却30 min，精密称重。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量。

热浸法：称取过2号筛的发酵猫爪草药材粉末4 g，精密称定后放置于250～300 mL的锥形瓶中，加入蒸馏水100 mL，塞紧瓶盖后称重，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾后保持微沸1 h。冷却后取下锥形瓶，拧紧瓶塞，称重，用蒸馏水补足损失的重量，摇匀后用滤纸过滤，精密量取滤液25 mL，放置在干燥为恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于烘干箱在105℃下干燥3 h后转移至干燥器中，冷却30 min称重。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量[3]。

2.3 多糖含量测定方法

葡萄糖、甘露糖对照品溶液的配制：精密称取葡萄糖标准品、甘露糖标准品各10 mg，加适量水溶解后定容至100 mL(即为每1 mL含0.1 mg)。0.2%蒽酮-浓硫酸溶液的配制：精密称取蒽酮试剂0.2 g，用适量浓硫酸溶解后定容至100 mL(现用现配)。

绘制标准曲线：分别精密吸取葡萄糖和甘露糖对照品溶液各5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL于50 mL容量瓶，加入蒸馏水定容至50 mL；再精密加入0.2%蒽酮-浓硫酸溶液各4 mL，混匀；显色60 min后于485 nm处测葡萄糖吸光度A，于285 nm处测甘露糖吸光度A[4]。以吸光度A为纵坐标，葡萄糖溶液和甘露糖溶液的浓度C(mg/mL)为横坐标。

制备供试品溶液：将发酵好的猫爪草药材于60℃干燥，精密称取10 g，加水回流提取(100 mL×2次)，2 h/次，趁热过滤，滤液合并，于60℃浓缩至约20 mL，加乙醇至含乙醇量为85%，密闭静置24 h，使用抽滤机抽滤，滤饼用80%乙醇洗涤2次，60℃水浴挥发尽乙醇，残留物用适量水于60℃水浴溶解，以5 000 r/min离心10 min，取上清液定容至50 mL，摇匀后即得供试品溶液。

精密量取供试品溶液0.1 mL，加蒽酮-浓硫酸溶液定容至50 mL，同法测定吸光度，依据标准曲线计算出样品溶液中多糖的含量。同法测定猫爪草原药中多糖含量。

式中，C—葡萄糖质量浓度(mg/mL)；D—样品稀释倍数；V1—提取液总体积(mL)；V2—取样体积(mL)；M—样品质量(mg)。

3 结果与分析

3.1 猫爪草的水分、浸出物含量测定结果

4种益生菌发酵猫爪草的水分、浸出物含量测定结果如表1所示。由此可知，与冷浸法相比热浸法测得水溶性浸出物含量较高。

表1 四种益生菌发酵猫爪草的水分、浸出物含量测定结果 单位：%

3.2 猫爪草多糖测定结果

将所得吸光度值A对葡萄糖浓度C进行最小二乘法回归，得到葡萄糖的标准曲线回归方程为：A=0.171 1C-0.105 7，R2=0.999 8(线性范围为20～100 μg)；将所得吸光度值A对甘露糖浓度C进行最小二乘法回归，得甘露糖的标准曲线回归方程为：A=0.005 1C+0.005 5，R2=0.997 3(线性范围为0.01～0.05 mg)，如表2、表3所示。葡萄糖在0.02～0.1 mg/mL浓度范围内，吸光度与浓度呈现良好的线性关系；甘露糖在0.01～0.05 mg/mL浓度范围内，吸光度与浓度呈现良好的线性关系，如图1、图2所示。

表2 葡萄糖线性相关性结果

表3 甘露糖线性相关性结果

图1 葡萄糖标准曲线 图2 甘露糖标准曲线

多糖测定结果见表4。结果表明与猫爪草原药多糖含量相比，由4种益生菌发酵后的猫爪草多糖含量均有提高，最高的是酵母菌组，为9.06%，其次是乳酸菌组，为8.63%。

表4 多糖测定结果 单位：%

4 讨论与分析

本实验对4种益生菌发酵后的猫爪草多糖的测定结果进行比较，通过最大吸收波长扫描，建立了紫外分光法测定葡萄糖和甘露糖的方法。结果表明酵母菌发酵后的猫爪草多糖产量最高，为9.06%；乳酸菌发酵后的猫爪草多糖含量次之，为8.63%。说明酵母菌和乳酸菌作为发酵菌种可使猫爪草多糖的提取率得到提高，表明酵母菌和乳酸菌发酵后的猫爪草多糖产量优于粪链球菌和枯草芽孢杆菌。

酵母菌和乳酸菌作为典型的糖菌，喜在含糖较高、酸性的环境中生长，猫爪草中富含糖分，可以作为酵母菌天然的营养体系。多糖含量的升高推测为酵母菌和乳酸菌代谢酶对于纤维素的降解，使多糖提取率增加。葡萄糖为发酵的最佳碳源，蛋白胨为最佳氮源，随着在培养基中的浓度不同，对中药发酵的影响相异较大。水提醇沉法是利用多糖具有溶解于水而不溶于醇类的特性来提取多糖的，但是多糖类物质又具有醇醚不溶性，如果溶液中的醇醚类物质过量就会使糖类物质沉淀析出。因此，乙醇加入量对发酵液中多糖提取产量的影响最大，其次是醇沉时间，醇沉时间过长或过短，对多糖提取的影响也较大。