神经系统药物电化学检测关键点辨析

黄 菲，周 慧，毛云飞，沈 明，金党琴，钱 琛

（1.扬州工业职业技术学院，江苏 扬州 225127；2.扬州大学，江苏 扬州 225002）

神经系统用药是指一类作用于人体中枢或周围神经系统，进而产生兴奋、抑制、麻醉、镇痛、修复等作用的药物，广义上包括抗精神病药、抗抑郁药、抗焦虑药、镇静催眠药、麻醉药、止痛药、抗癫痫药、神经退行性疾病治疗药、中枢兴奋药以及与之紧密相关的部分心脑血管系统用药。［1］此类药物具有重要的临床价值，但大多具有一定的成瘾性，滥用后极易产生难以逆转的机体或组织损伤，因而被严格管控，其检测一直都是研究热点。电化学方法简单、灵敏、快速，在该领域发挥了重要作用，成果丰硕。笔者曾撰写多篇论文从宏观层面展现了不同类型神经系统药物电化学检测的研究现状及发展趋势。［2～8］但是，如何从微观细节方面来科学、合理地设计、完成和评价试验，从整体上总结共通的规律，目前尚无相关报道。鉴于此，本文基于现有成果，结合笔者多年的实际研究经验，初步探讨检测过程中的一些关键之处，以期能与业界同仁交流学习。

一般而言，电化学检测主要包括“目标辨识、电极制备、方法选择、效果评价”四个方面，故本文据此展开论述。需要说明的是，以液态汞电极为基础的极谱分析方法因其严重的环境污染性已被历史淘汰，这里就不再讨论。

一、目标辨识

分子自身的活性是实施电化学检测的基础，很大程度上决定了后续过程的难度。根据活性强弱及分子构型，神经系统药物可粗略地分为四类。

1.强活性（Active，A型）。A型药物通常结构简单，碳链较短，具有较多的酚羟基、氨基等电活性基团或叔醇、烯醇等不稳定结构，易发生氧化还原反应，电子转移速率较快，自身及其酸式盐水溶性较好。A型药物在电极上一般都能产生良好的伏安响应，过电位很低，且测试条件温和。代表性药物如：肾上腺素、多巴胺等儿茶酚胺类神经递质。

2.中等活性（Medium，M型）。M型药物分子通常具有一定的平面共轭结构或三维畸形空间构象。前者分子中大多包含具有孤对电子的S或N原子，具有较强的给电子能力，电化学过程中容易失去电子形成阳离子自由基。后者由于空间受到一定限制、产生挤压和变形，分子能量较高，不太稳定，也能发生氧化还原反应。它们自身水溶性一般，其酸式盐却易溶于水。M型药物存在一定的过电位，在电极上能产生明显的伏安响应，但往往峰形较差，电流强度偏低。代表性药物如：吩噻嗪类及二苯氧氮平类抗精神病药、三环类抗抑郁药、β受体阻滞剂、吗啡类镇痛药、可卡因类局麻药。

3.低活性（Weak，W型）。W型药物分子中虽然可能存在少量电活性或给电子基团，但环状结构过多或碳链过长，位阻很大，电子传递受到阻碍，若无外部能量输入，很难发生氧化还原反应。它们水溶性较差，一般也不形成酸式盐。W型药物具有很高的过电位，通常只能在高酸度（或碱度）溶液、高氧化（或还原）电位条件下，在特定电极上产生非常微弱的伏安响应。代表性药物如：苯二氮䓬类镇静剂、丁酰苯类及苯甲酰胺类抗精神病药。

4.非活性（Inactive，I型）。I型药物分子中既无任何电活性或给电子基团，又没有高能量、不稳定的分子结构，故无法发生氧化还原反应，基本上在任何电极上都不产生伏安响应。代表性药物如：氟烷类全麻药。

总而言之，A型药物实施电化学检测最为简便，I型药物则毫无意义，M型和W型药物需要选择合适的电极进行检测。这里有一个经验规律，即：在不确定药物类型的情况下，可在pH=1～13的磷酸缓冲溶液中，采用裸玻碳或碳糊电极于-0.4 V至+1.2 V进行伏安扫描，若能发现药物分子产生响应，就可进行电化学检测，反之则很困难。

二、电极制备

工作电极是实施分析测试的工具，直接影响检测效能，如何构建应基于药物分子的性质。普通的裸固体电极（金属电极、碳基电极、离子选择电极、导电玻璃等）因表面富集、催化、抗污染等性能不足，目前已很少直接用于检测，取而代之的主要是化学修饰电极。通过对表面进行适当地裁剪或功能化，赋予电极特殊的空腔结构、优异的导电性能、催化活性和分子识别性能，达到灵敏检测的目的。［9～10］文献［9～10］对各种修饰电极的制备工艺及影响因素进行了系统总结，这里不再赘述，主要讨论筛选电极的思路。

1.A型药物。由于其电活性强，可采用的电极范围广。通常有如下几种选择：第一，药物水溶性好，电离后易带电荷，可考虑在电极界面构建单层或多层具有羧基、磺酸基的结构，例如表面经阳极化处理的热解石墨电极、3-巯基丙酸自组装膜修饰金电极、聚对氨基苯磺酸修饰玻碳电极等。在特定酸度的溶液中，利用两者pKa不同导致所带电荷相反这种现象，通过静电吸引作用进行检测。第二，药物中活性基团较多，易于氧化，可在电极界面引入含有过渡金属的催化物质，例如普鲁士蓝修饰电极、杂多酸修饰电极、超分子-过渡金属配合物修饰电极、金属-有机框架材料修饰电极等。利用过渡金属可提供不稳定的d轨道单电子充当亲核试剂或空的价层d轨道作为亲电试剂，形成中间产物，降低反应活化能，促进氧化还原反应进行。第三，利用纳米材料及其复合物自身的电子效应、催化效应和吸附效应，降低药物分子的过电位，增加峰电流，提高灵敏度。

2.M型药物。由于其电活性和水溶性一般，选择工作电极必须有针对性。一般来说，可考虑如下几种方案：第一，药物分子自身难溶于水，其酸式盐却易溶于水，可在电极界面制备一层具有疏水性的长烷基链，例如十六烷基硫醇自组装膜修饰金电极、十八烷基胺修饰碳糊电极等。在中性或弱碱性水溶液中，质子化的药物分子脱去H+后变成中性分子渗透至密集的烷基链中，借助两者之间强烈的疏水作用进行萃取，实现药物分子在电极界面的有效富集，增加微区浓度，进而提高检测信号强度。第二，在电极界面固定诸如Nafion之类的离子交换树脂或者杯芳烃、环糊精、冠醚、卟啉、酞菁之类的超分子结构，利用其与药物分子之间的亲-疏水或者主-客体分子识别作用，通过增强富集效果实现灵敏检测。第三，和A型药物类似，采用纳米材料修饰电极进行测定，尤其是碳纳米管、石墨烯等宽电位窗口、高导电性、强疏水性的碳质纳米材料，效果显著。

3.W型药物。此类药物电化学活性低下，水溶性较差，实施检测的关键在于同时增强富集的有效性和电极的导电性。最常用的对策是采用纳米复合材料，例如“分子印迹膜+贵金属纳米颗粒”、“导电聚合膜+碳纳米管”、“离子液体+石墨烯”、“壳聚糖+无机氧化物纳米颗粒”等体系。上述双元体系中，分子印迹膜具有和药物分子相匹配的空间结构，可实现专一性识别；壳聚糖具有特殊的生物兼容性，能固定药物分子；导电聚合膜和离子液体本身就兼具导电性和疏水性。这些物质再与纳米材料相结合，就能发挥协同作用，增强响应信号。

不过，电极制备过程中，有三点需要注意。

一是电极制备的简便性。相对而言，多组分修饰材料功能要丰富一些，但无谓地增加组分也会降低检测效能。例如，在常见的“碳纳米管+Nafion”体系中，前者起导电、催化作用，后者行使富集功能。如再往体系中添加不导电的壳聚糖，电极的富集功能倒是得到提高，但导电性能却大幅下降，极大抑制电流信号，灵敏度反而降低。此外，组分越多，由于各自理化性质截然不同，导致自组装、电聚合、电沉积等精细修饰方式难以实施，滴涂、混合等粗放型固定手段则会频繁使用，极大地影响电极性能的均匀性和稳定性。再如，多层膜修饰电极虽然设计巧妙、结构有序，可以发展成某些具有特殊功能的分子器件，但结构及尺寸的扩大不仅极大地限制电子的传递能力，同样显著增加了电极制备难度，除了理论意义外，对检测并无实质性帮助。

二是电极表征的针对性。工作电极制备完成后，并非一定要进行“大而全”式的表征堆砌，应着眼性能指标进行相关测试。例如，导电性采用循环伏安法和电化学阻抗法足以；亲—疏水性可借助接触角试验说明；表面形貌通过扫描电镜和原子力显微镜便可直接观测；修饰材料自身内部结构可利用X射线衍射谱、红外-反射光谱、拉曼光谱、透射电镜来确定。

三是电极性能的实用性。使用何种工作电极应根据药物分子自身的性质和检测要求来确定。例如，测定儿茶酚胺类神经递质，所有电极的检测限都相差不大，均为10-8～10-7mol/L。此时更适宜采用普通化学修饰电极，如化学修饰碳糊电极、自组装膜修饰电极、导电聚合膜修饰电极等。与之相比，纳米材料的合成与组装不仅烦琐，且修饰电极的稳定性大多不及前者。再如，对于常规的药样分析，检测限通常只需达到μmol/L级即可，一般的离子选择电极就能满足要求，根本无需使用化学修饰电极。

三、方法选择

检测方法关乎结果的准确度及可信度，目前主要采用示差脉冲伏安法和方波伏安法进行定量分析，一般具有高精度、高分辨率的优点。但问题在于：一是这两种方法受背景噪声影响较大，尤其是在对药物进行超痕量（n mol/L或f mol/L级）分析时，很难判断响应信号的来源，检测限不易认定；二是它们仅适用于直接检测A型、M型和部分W型药物，对于其它药物亦无能为力。

一般而言，检测前会尽可能优化及固定各种试验参数，比如溶液酸度、缓冲溶液种类和浓度、富集时间及电位、扫描速度等。对于低浓度测定，通常加做空白试验进行比对，可采用半经验的外推法来预估检测限，即：检测限通常比能直接观测到的药物最低响应信号强度低0.5～1个数量级。

对于极低活性的W型药物，可考虑采用不以伏安或电流为主要响应信号的间接测定法。例如，让药物分子与某种过渡金属离子按确定比例形成稳定的络合物，通过考察络合物的电位响应，借助能斯特方程检测其浓度，进而换算成药物分子浓度。或者固定金属离子的浓度，改变药物分子浓度，通过检测金属离子电流或电位的变化值，考察信号变化值与浓度变化值之间的关系，依此建立浓度分析曲线。再如，对于结构及位阻较大的药物分子，在电流和电位都不易测定的情况下，可利用其自身的体积效应，选择特定电化学探针，通过考察电极容抗或阻抗的变化值来进行测定。当然，间接测定法的检测限都不会太低，一般只能达到μmol/L级。如果要进行低浓度测定，那就只能采用电致化学发光、电化学免疫分析之类的高灵敏度分析方法了。

四、效果评价

电化学检测完成后需要对试验进行客观评价，这关系到所使用的工作电极和建立的分析方法能否得到推广应用。一般来讲，主要指标有如下几个方面。

1.灵敏度。作为最重要的效能指标“检测限”反映了电极的探测能力，理论上越低越好。但是，过分追求较低的检测限也不足取，这意味着电极修饰的复杂程度和制备成本会成倍增加，应根据药物的试样形态和活性来确定。一方面，对于普通的药样，检测限为μmol/L级即可；对于血样、尿样、唾液样、脑脊液样等人体体液样品，正常应达到n mol/L级；而对于粪便样、毛发样等特殊形态试样，则需低至f mol/L级。另一方面，正常条件下，对于A型药物，由于电极反应迅速，信号变化太快，检测限通常控制在10-8～10-7mol/L；对于M型药物，精细修饰后，电极检测效能会大幅提升，检测限可低至10-9～10-8mol/L；而对于W型药物，由于电化学反应速度过慢，信号难以监测，达到10-7～10-6mol/L亦能接受。

2.选择性。电极分子识别能力的强弱决定了其能否有效应对多组分或复杂样品分析。根据经验，正常情况下，一般通过观察峰电位差值或峰形好坏来判断电极的选择性。以双组分试样为例，对于结构相似的同系列药物，如果两者的峰电位差不低于50 mV，即可认为电极可以区分。对于非同系列药物，如果其中一组分产生响应，而另一组分50倍浓度于前者情况下都不形成明显干扰，则可认为电极选择性良好。需要特别指出的是，对于手性药物，由于光学对映体具有完全对称的分子结构，理论上两者的电化学活性完全等同。此时，若采用电化学方法进行区分并非良策。这是因为：高效液相色谱、毛细管电泳等传统手段通常需要在固定相和流动相中借助上万个塔板对药物分子进行反复分配才能加以分离，而电化学方法仅仅只有数个塔板和分配机会，其识别能力完全不能和前者相提并论。

3.稳定性。使用寿命是决定电极能否商业化生产的重要指标。一般来说，电极连续使用一段时间后，表面历经多次氧化还原过程，导致修饰层脱落或产生钝化现象，致使响应信号质量变差。以电流型传感器为例，连续使用4周后，如还能保持信号强度在初始值的90%以上，就可认为电极具有高稳定性。事实上，由于组装方式的巨大差异，纳米材料修饰电极的稳定性一般不如传统的化学修饰电极，不仅膜层易发生脱附，表面也容易老化失活，不宜长时间使用和贮存。

4.再现性。检测结果能否重现关系到检测方法的可靠性。一般来说，在外部环境、试验条件、人为操作没有明显异常的情况下，再现性与电极的稳定性息息相关，稳定性高，再现性好，反之亦然。通常，同一试样经5～8次平行测定后，所得结果的相对标准偏差如不高于5%，则可认为电极具有较高的再现性。

5.再生性。电极表面的可更新能力极大影响检测效率及结果的再现性。通常来讲，每次测试完成后，电极在空白溶液中经过数次循环扫描，其性能如能恢复到使用前状态，就能判定具有良好的再生性。一般而言，借助亲-疏水作用、分子印迹或免疫传感等技术进行检测识别的电极，由于分子间相互作用过于强烈，结合力大，不易洗脱，因而再生性要差一些，基本上属于一次性使用，再次测试前电极需重新制备，极其烦琐耗时。

6.线性范围。工作曲线是进行定量分析的基础。浓度线性范围一般越宽越好，利于扩大适用面。通常在低浓度段和高浓度段各自会出现一个线性区间，相对而言，前者更具有实际意义。

7.准确度、精密度。准确度和精密度关系到检测方法的公信度。普通的加标回收试验不足以说明其有效性，较为理想的做法是设置一定的置信区间，采用数理统计中的F检验和t检验，比较所提方法与经典方法所得结果，如两组数据不存在显著性差异，则可判定检测方法较为可靠。

8.适用性。对不同环境的适用性反映了工作电极和检测方法的实用价值，尤其是面对复杂的生物样品。单纯的药样分析因试验条件过于理想，局限性太强，仅具有理论意义。