维生素D和甲状腺癌关系的研究进展

刘文斌 郑海涛

甲状腺癌是世界范围内最常见的内分泌肿瘤，且世界各国甲状腺癌的发病率持续上升[1]。随着超声的普及以及人们健康查体意识的增强，越来越多的甲状腺癌患者被早期发现，甲状腺癌的防治也引起了人们更多的关注。维生素D及其活性代谢物是人体骨骼健康的重要营养物质。紫外线照射皮肤可以将7-脱氢胆固醇转化为维生素D3，维生素D3在肝脏和肾脏中代谢成活性形式-骨化三醇。它具有多种生物学效应，除了能维持钙磷代谢平衡及骨骼健康之外，还能影响到机体多种细胞的增殖、分化和凋亡。本文回顾维生素D在甲状腺癌中的研究进展，并就维生素D受体(VDR)与维生素D代谢关键酶在甲状腺癌中差异性表达以及维生素D的抑癌机制进行分析，以期为甲状腺癌的防治提供理论参考。

1 维生素D与甲状腺癌的发生

1.1 维生素D与癌症 维生素D以往被认为是一种必需的营养物质，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，主要作用是调节骨代谢和钙磷平衡。近几年来，维生素D在非骨骼活动中的重要性已经被研究，大量研究表明，维生素D缺乏也与许多其他骨骼外疾病(如癌症)的风险增加有关[2-5]。维生素D活性形式1，25-(OH)2D3主要与核维生素D受体(VDR)结合，控制200多个基因的表达，发挥生理作用[6，7]。肺、前列腺、卵巢和结直肠等组织都有VDR表达，并对1，25-(OH)2D3有反应。大多数流行病学研究及临床数据表明，血清维生素 D 水平与多种癌症风险相关，如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等，而且缺乏或低血清维生素D水平与增加患多种癌症的风险之间存在相关性[8，9]。维生素D作为一种激素前体，在肝脏和肾脏中经历两步代谢，产生一种生物活性代谢物--钙三醇，它与维生素D受体(VDR)结合，调节多种基因的表达。除经典代谢途径外，有研究发现维生素D也可以通过Cyp11a1驱动的旁路代谢途径被代谢和激活[10，11]。维生素D具有多种抗癌作用，如调控细胞增殖、分化、凋亡和抗血管生成等，对肿瘤的发展和发展有不同的影响。而维生素D信号的激活可能是预防和治疗癌症的一种新的策略。

1.2 维生素D水平与甲状腺癌发生 目前，临床上对甲状腺癌致病原因及具体发病机制仍在探讨中，有些学者认为化学毒素[12]、胰岛素抵抗[13]、代谢综合征[14]以及维生素D缺乏[15]等是甲状腺癌的潜在危险因素。近年来，医学界对血清维生素 D 有了新的认识，维生素D缺乏也被认为是甲状腺癌的危险因素[16]。早在2010年，就已经有研究者在乳头状、滤泡状、未分化性甲状腺癌患者外周血中发现低浓度的1，25-(OH)2D3，并且在未分化性甲状腺癌中检测到的1，25-(OH)2D3含量最低[17]。这表明维生素D低水平患者可能增加患有甲状腺癌的风险。同样，Roskies等[18]记录了接受甲状腺切除术患者术前维生素D浓度，将37.5 nmol/L 作为既定阈值(低于既定阈值为维生素D缺乏)，并根据术后病理情况进行数据分析，结果发现在甲状腺癌患者中维生素D往往是缺乏的。另外，有学者通过计算多分类变量逻辑回归来评估维生素D和乳头状甲状腺癌(PTC)之间的关系，发现血浆中高水平25-(OH)D会降低患PTC的风险[19]。这表明高水平维生素D有利于甲状腺癌的预防，维生素D摄入量可被视为甲状腺癌发病率的预防因素。

1.3 维生素D水平与甲状腺癌病理分期 Stepien等[17]不仅发现甲状腺癌中维生素D水平低，也发现恶性程度高的未分化癌中维生素D水平最低。甚至，有人推测试图维生素D缺乏程度会影响甲状腺癌病理分期，Kim 等[20]对接受甲状腺全切除术的548名女性PTC患者，根据术前血清25-(OH)D水平，回顾性分析PTC的临床病理特点，结果发现肿瘤>1 cm 或有淋巴结转移的患者术前维生素 D 水平明显降低。并且，根据易诗琼等[21，22]的研究结果显示，血清维生素D浓度与甲状腺癌的浸润深度及分期呈负相关，与肿瘤分化程度呈正相关，且为影响甲状腺癌患者预后的独立危险因素。但是又有研究显示,维生素D缺乏与PTC的恶化与转移似乎并无明显关系[23，24]。Yildiz 等[25]针对179例行甲状腺切除的患者，于手术前1 d采血，测得血清25-(OH)D水平，将维生素D浓度分为<10 ng/ml、11～20 ng/ml、20～29 ng/ml和≥30 ng/ml 4组，分别对术后病理、淋巴结情况进行数据分析，结果显示4组维生素浓度在良恶性肿瘤中以及淋巴结转移中均无显著差异。这些报道的不一致性，可能与受试者的选择、地区因素、VDR多态性等有关。

2 维生素D信号通路与甲状腺癌

2.1 维生素D信号通路 维生素D3与血液中的维生素D结合蛋白结合后被运输到肝脏，在肝脏经过25-羟化酶(CYP2R1、CYP27A1)催化下转变为25-羟维生素D3[25-(OH)2D3]；进入血液循环后同样与维生素D结合蛋白结合，随后被运输到肾脏，在肾脏1α-羟化酶(CYP27B1)催化下生成具有激素活性的代谢产物1,25-二羟维生素D3[1，25-(OH)2D3]，而1，25-(OH)2D324-羟化酶(CYP24A1)主要参与维生素D的分解代谢。[1，25-(OH)2D3]是的维生素D的生物活性状态，它主要通过基因组以及非基因组途径与维生素D受体(VDR)结合发挥抗肿瘤增殖、分化和免疫调节作用。在基因组通路中，核维生素D-nVDR与维甲酸-X-受体(RXR)形成异二聚体复合体，并与维生素D反应元件(VDRE)结合，触发下游目标CDKN1A、C-MYC、Cdh1和CYP24A1的转录。1，25-(OH)2D3的非基因组作用主要表现为激活信号分子如磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷脂酶C和磷脂酶A2(PLA2)和 p21ras，其次是快速生成次级信使如环磷酸腺苷(camp)、钙离子(Ca2+)、脂肪酸和3-磷酸肌醇(3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇)。这导致相应蛋白激酶的激活。此外，非基因组作用还包括Ca2+和 Cl-通道的开放。据报道，wnt/β-catenin信号通路在PTC的发生、发展中起重要作用[26，27]。在Pang 等[28]的研究中VDR-KD可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，减弱维生素D在PTC中的抗增殖、促凋亡和抗侵袭作用。这也反应出VDR可以作为治疗甲状腺癌的一种新的靶点，可应用于今后的临床实践，提高甲状腺癌患者的临床疗效。

2.2 基因多态性 近年来，大量研究发现维生素D受体(VDR)基因限制性片段长度多态性与各种类型癌症的相关性。Kostner等[29]对之前发表过的研究进行meta分析，发现VDR基因多态性与乳腺癌(Fok 1，Bsm1，Taq 1，Apa 1，polyA)，前列腺(Fok 1，Bsm1，Taq 1，polyA)，皮肤(Fok 1，Bsm1，A-1210)，直肠癌(Fok 1，Bsm1)，卵巢(Fok 1，Apa 1)和膀胱(Fok1，Apa 1)及肾癌(Taq1，Apa 1)均有明显的相关性。为了了解VDR多态性与甲状腺癌的联系，Penna-Martinez等[30]对172例甲状腺癌患者(乳头状癌132例，滤泡状癌40例)和321例健康对照组(HC)的VDR基因多态性位点 ApaI、TaqI、BsmI和FokI进行对比分析，结果发现ApaI (rs7975232)的AA和 FokI (rs10735810)的FF等位基因与单倍体型tABF在滤泡性甲状腺癌(FTC)患者中的发生率明显低于HC，而单倍体型Tabf在FTC患者的发生率则较高，相比之下，无论是基因型还是单倍体型在PTC与HC之间都没有差异，这项研究表明ApaI、FokI的等位基因AA和FF以及单倍型tABF是FTC的保护因素，而单倍型Tabf是FTC的风险因素。这是第一个将 VDR 多态性与甲状腺癌联系起来的报告，尚需要在更多患者的研究中得到证实。随后，有研究报道了CYP27B1的罕见单倍型rs10877012A/rs4646536T可能对 PTC 有保护作用，而且还报道了CYP24A1 rs2296241多态性与DTC的关系，含有rs2296241等位基因的单倍型rs2248137C/rs2296241A对PTC有保护作用，而单倍型rs927650C/rs2296241G和rs927650C/rs2248137C/rs 2296241G可能增加DTC风险，尤其是对FTC影响较大[31]。维生素D通路中的基因多态性对甲状腺癌的影响，Carvalho等[32]的研究发现CYP2R1 rs2060793小等位基因(A等位基因)在DTC的淋巴结或远处转移患者中的频率较低，而DHCR 7(调节维生素D3的关键酶) rs12785878小等位基因(G等位基因)在DTC患者中的频率增加，这表明DHCR 7 rs12785878是甲状腺癌新的危险位点，CYP2R1 rs2060793可能具有预防甲状腺癌进展的作用。在甲状腺髓样癌(MTC)的研究中，Ramezani等[33]提取MTC和健康者VDR基因组DNA，进行PCR测序。结果发现FokI和BsmI多态性的基因型和等位基因频率在试验组和对照组之间没有显着性差异。而在Tru9I多态性上，试验组Tt基因型和t等位基因频率与对照组比较有显著差异性(P<0.05)。同时，该研究发现Tt基因型和t等位基因频率与MTC类型和病情加重密切相关，这也反应出Tru9I多态性与甲状腺髓样癌的患病率相关。以上的研究结果说明维生素D受体的多态性可以影响甲状腺癌的发病率。

2.3 VDR、CYP27B1和CYP24A1 VDR蛋白介导维生素D的抗肿瘤效应，而CYP27B1和CYP24A1参与1，25-(OH)2D3代谢。Clinckspoor等[34]通过免疫组化与实时定量RT-PCR技术分析，与正常甲状腺相比，DTC和良性甲状腺肿瘤中VDR、CYP27B1和CYP24A1的表达均增加。可能的解释是在局部肿瘤组织中维生素D代谢失活阻断了维生素D的快速抗肿瘤反应，并提示1，25-(OH)2D3具有一定的抗肿瘤作用。在DTC与良性甲状腺肿瘤比较中，DTC患者VDR升高更明显，CYP24A1表达则较低，CYP27B1表达相似。这提示在DTC患者中，可能通过VDR的高表达与CYP24A1的低表达来增强1，25-(OH)2-D3的抗肿瘤作用。另外，在有淋巴结转移的PTC中，VDR和CYP24A1较未转移的PTC降低；在ATC中，VDR的表达常缺失，而CYP27B1和CYP24A1的表达与DTC相当；Ki 67高表达(>30%)或远处转移的ATC以VDR、CYP24A1、CYP27B1染色阴性为特征。这表明随着肿瘤恶性程度增高，1，25-(OH)2D3的信号通路会减弱。这也在Yavropoulou等[35]研究中得到印证。

2.4 nVDR和mVDR 传统上，1，25-(OH)2-D3的生物学效应被认为是通过它与细胞核维生素D受体(nVDR)的相互作用来实现的。在20世纪80年代中期，人们观察到VDR在调节基因表达的同时，还通过非基因调控方式介导了一些细胞内的迅速改变，例如参与细胞内信号转导通路，这引起了科学界的兴趣。基于一些不能与nVDR结合的维生素D类似物能够引起1，25-(OH)2D3的快速反应，有人发现一种独特的细胞膜mVDR[36]，这种mVDR可以显示在细胞表面和核周区域，而不是在细胞核内。在质膜上，维生素D受体定位于腔隙，结合腔隙蛋白-1和磷脂酶A2[37，38]。但对于nVDR是否参与1，25-(OH)2D3的非基因组作用一直存在一些争论。易诗琼等[21]试图阐明VDR在甲状腺癌中的表达模式，他们分析PTC中滤泡状癌细胞及其周围非肿瘤性甲状腺组织(NNTT)VDR的表达，肿瘤组中VDR mRNA 和蛋白表达均高于 NNTT 组，并且在所有的病例中，VDR蛋白质全部定位于细胞质和细胞膜中，大多数病例细胞质阳性率较高，而NNTT细胞膜阳性率比癌细胞的低。虽然不能确定PTC中膜性mVDR表达增加是从细胞核到细胞膜的VDR易位还是膜VDR表达的本身增加，但膜mVDR表达的增加可作为滤泡性甲状腺细胞对异常肿瘤细胞增殖的补偿机制。

2.5 CYP24A1与甲状腺癌的治疗 人们推测维生素D信号通路的阻断可能是甲状腺癌发生发展的原因之一，在此基础上，通过维持正常的维生素D信号通路，如通过抑制CYP24A1的代谢作用或补充1，25-(OH)2D3可能有助于甲状腺癌的治疗。从Hu等[39]的研究中发现在ATC细胞系中将CYP24A1基因敲除后，甲状腺癌细胞的增殖受到明显抑制，并且CYP24A1基因敲除可明显增强1，25-(OH)2D3对癌细胞的抗增殖作用。这可以从侧面反应出抑制CYP24A1的代谢可能有助于甲状腺癌的治疗。先前有多项研究显示CYP24A1抑制剂在前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等能增强1，25-(OH)2-D3的抗肿瘤细胞增殖活性，但在甲状腺癌中的临床应用尚未有明确报道。但有研究显示PTC组织中CYP24A1表达增加，在Ⅲ、Ⅳ期肿瘤中表达进一步增加，他们认为CYP24A1的过表达与BRAF(V600E)突变密切相关，BRAF(V600E)抑制剂PLX 4720能显著下调CYP24A1的表达，增强1，25-(OH)2D3在甲状腺癌细胞中的抗增殖作用。目前仍需要有更多的研究来证明CYP24A1抑制剂在甲状腺癌中的作用[40]。另外，Sharma等[41]用VDR激动剂(骨化三醇或 DP006)治疗甲状腺癌6 d后，用活细胞分析法检测细胞生长情况。他们发现具有FF FokI VDR 基因型的细胞系中CYP24A1 基线水平较高，且对VDR激动剂的反应较弱，经VDR激动剂治疗后对癌细胞生长无明显抑制作用，可能的原因是高水平的CYP24A1导致1，25-(OH)2D3的局部快速失活，存在活性较低的1，25-(OH)2D3可用于 VDR 的结合和激活。而具有ff FokI VDR 基因型的细胞系CYP24A1基线水平较低，对VDR激动剂治疗后反应较大，甲状腺癌细胞存活数量减少。他们推测通过分析甲状腺癌细胞中对VDR激动剂治疗敏感或耐药的可识别标记物，可能有助于甲状腺癌的个体化治疗。由此，在甲状腺癌的治疗方面，将来可以从结合CYP24A1抑制剂以提高1，25-(OH)2D3治疗效果方面展开进一步研究。

3 维生素D与甲状腺癌细胞的增殖、分化、凋亡

3.1 维生素D抑制甲状腺癌细胞增殖 1，25-(OH)2D3具有较强的抗肿瘤活性作用。以往的研究表明，1，25-(OH)2D3可通过降低转录因子E2F1的表达或介导CDKI-p27的积累使停滞在G0-G1期的甲状腺癌细胞比例增加，进而发挥抗肿瘤细胞增殖效应[42-45]。现普遍认为肿瘤干细胞(CSCs)与肿瘤的发生、复发和转移有关，而甲状腺正常干细胞基因突变后能够演变成肿瘤干细胞(CSCs)，最终发展成甲状腺癌[46]。Peng等[47]发现1，25-(OH)2D3能通过细胞周期阻滞抑制甲状腺未分化癌细胞来源的CSCs的增殖，并且能在甲状腺CSCs中发挥促进分化的作用。而CSCs又与上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)具有关联性[48，49]。人甲状腺癌细胞可通过完成EMT，促使甲状腺CSC的发生[50]。有研究发现，1，25-(OH)2D3可以抑制甲状腺CSCs 的 EMT 的转化，进而抑制甲状腺肿瘤细胞的干性[51]。并且这项研究还提示EMT过程或许可以作为维生素 D 抗甲状腺 CSCs 的潜在靶点，提高未分化型甲状腺癌的临床疗效，改善患者预后。

3.2 维生素D促进甲状腺癌细胞分化 已有众多研究证明1，25-(OH)2D3可促进如白血病细胞、结肠癌细胞等多种癌细胞分化，但对甲状腺癌细胞的研究相对较少。Dackiw等[52]将人甲状腺滤泡癌(FTC)衍生细胞(WRO)移植于小鼠颈部，经1，25-(OH)2D3处理后的小鼠肿瘤体积明显小于对照组，肺转移发生率也较低。切除肿瘤标本后进一步研究发现用1，25-(OH)2D3处理的小鼠显示甲状腺球蛋白染色恢复分化的迹象。这与p27蛋白恢复在甲状腺癌细胞中的积聚有关。这项研究结果表明1，25-(OH)2D3可以抑制小鼠体内FTC细胞增殖、预防肿瘤转移，还可以诱导其分化。另外，有研究表明在体外ATC细胞系中，经1，25-(OH)2D3处理后，分化指标钠/碘转运体和甲状腺球蛋白mRNA的表达仅略有增加，对促甲状腺激素受体和甲状腺过氧化物酶mRNA的表达无明显影响[31]。但是该项研究者也提出，由于甲状腺癌细胞系是原始肿瘤细胞的体外培养的结果，它们可能已经失去了对抗癌药物的敏感性[31]。1，25-(OH)2D3及其类似物CD578在该研究中的细胞系影响明显，并不完全代表在未分化的甲状腺癌中效果明显，这是进一步进行体内研究的有力依据。总之，目前有较少的确切证据证明维生素D能促进甲状腺癌细胞分化。

3.3 维生素D诱导甲状腺癌细胞凋亡 1，25-(OH)2D3不仅能抑制肿瘤细胞增殖、诱导其分化，对促使肿瘤细胞凋亡也起重要作用[53]。肿瘤细胞凋亡的调控在肿瘤发生、发展过程中具有非常重要的作用，虽然Clinckspoor等[34]没有发现1，25-(OH)2D3影响甲状腺肿瘤干细胞的凋亡，但是有人发现活性氧(ROS)在化疗药物诱导的细胞凋亡中起重要作用，而1，25-(OH)2D3可调节ROS的产生[54-56]。Zhang等[57]将1，25-(OH)2-D3单独处理ATC细胞，未发现1，25-(OH)2D3诱导ATC细胞凋亡。而阿霉素(ADM)可诱导ATC细胞凋亡，并且经高浓度1，25-(OH)2D3预处理ATC细胞后，可明显增加ADM诱导的ATC细胞凋亡。他们继续深入研究，用H2-DCFDA法测定ATC细胞内ROS的产生，结果发现1，25-(OH)2D3不能增加 ATC 细胞内 ROS 的产生，而ADM可增加ROS的产生，并且高浓度1，25-(OH)2D3和ADM联合治疗后可显著增加细胞内ROS的产生。为了进一步明确ROS和ATC细胞凋亡的关系，研究者将抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)用作细胞内活性氧清除剂，发现NAC可抑制1，25-(OH)2D3和ADM联合治疗诱导的 ATC 细胞凋亡。以上研究结果表明，虽然1，25-(OH)2D3不能直接诱导甲状腺癌细胞凋亡，但它可促进ADM治疗后ATC细胞内活性氧的产生，进而增强ADM导致的细胞凋亡效应。

RAS-MEK-ERK，在近几十年深入研究基础上，已成为一条经典的肿瘤信号传导通路。这条信号通路与多个癌种的发生密切相关，调控着肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡。最近，Li等[58]从这一经典信号通路入手，探讨1，25-(OH)2D3在甲状腺乳头状癌的增殖和凋亡中可能的机制。经1，25-(OH)2D3处理甲状腺乳头状癌TPC-1细胞系后，细胞增殖、集落形成和迁移能力明显降低。凋亡细胞数明显增加，Ki 67蛋白表达降低，Caspase-3蛋白表达上调。RAS、p-ERK 1/2和p-MEK的磷酸化水平降低。与之相比，1，25-(OH)2D3+ML-098(RAS激动剂)处理TPC-1细胞系后，细胞的集落形成和迁移能力明显增强。凋亡细胞数减少，Ki 67蛋白水平升高。Caspase-3蛋白水平降低，Ras-MEK-ERK水平升高.而且，1，25-(OH)2D3的抗肿瘤活性被RAS激动剂ML-098逆转。由此可见，11，25-(OH)2D3可能通过抑制Ras-MEK-ERK途径的活性，抑制甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1的活性，促进细胞凋亡。

分化型甲状腺癌(DTC)的治疗目前首选手术，且手术预后效果较好。但使用标准的积极手术治疗的决定仍然是有争议的，美国甲状腺协会(ATA)指南推荐的治疗方法更为保守[59]，高危患者是积极治疗的，低风险患者可能更适合保守治疗。现影响甲状腺癌发病的关键信号通路的分子机制从理论向临床实践转变，可以为每个DTC患者提供更多的治疗方案。

维生素D信号在甲状腺癌中起重要作用，无论是作为单一的药物还是与其他抗肿瘤药物联合治疗，靶向维生素D信号转导被认为是治疗甲状腺癌的一个很好的选择。虽然维生素D在甲状腺癌治疗中的作用仍然是模糊的，我们期待未来的临床试验通过探索维生素D在甲状腺癌中的作用机制，用适当剂量的维生素D或其类似物，以及联合化疗药物来治疗甲状腺癌患者，从而达到经济有效的目的。