高效液相色谱分析样品处理技术进展

严玲，毛琼丽，石豪，朱艳，李先芝，2，陈彦和

（1.劲牌有限公司，湖北大冶 435100；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435100）

高效液相色谱分析法的样品处理关系测定结果的准确性和分析时长。样品处理的目的包括：去除复杂基质或其它干扰物的影响，将待测成分尽可能多的提取出来；浓缩痕量被测组分，提高方法的灵敏度，降低检测限；利用衍生化或其它反应，使被测物转化成为检测灵敏度更高的物质或转化为能够与样本中干扰组分分离的物质，提高方法的灵敏度和选择性；去除杂质，纯化样品，保护分析仪器以及测试系统等。

高效液相色谱分析法的样品处理应该在保证待测组分选择性好、回收率高的基础上，尽量满足使用的设备和试剂经济、安全，操作过程简便，处理效率高，应用范围广，可以联机操作等条件。随着技术不断发展，色谱柱不断改进，超高效液相色谱的广泛应用，仪器分析花费的时间在整个分析过程中占比越来越小，样品处理过程逐渐成为影响样品分析效率的主要因素。因此简便、高效、经济、安全的样品处理方法逐渐成为色谱分析研究的前沿课题。常见的样品处理技术包括液–液萃取、固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取、微波辅助萃取、浊点萃取等。

1 液–液萃取技术

1.1 原理

液–液萃取（Liquid-Liquid extraction，LLE）是利用被测样品中目标成分在两种互不相溶的溶剂中溶解度不同，把目标物从原来的溶剂体系中抽提至新的溶剂体系中的过程。液–液萃取可以实现对目标化合物进行分离、纯化、去除杂质的目的，一般在常温常压下开展，条件温和，可以保持目标物理化性质的稳定，处理能力强，回收率高，应用相当广泛。目前随着样品处理技术的发展，液–液萃取技术的理论不断创新，研究范围不断扩大，包括常规液–液萃取、分散液–液微萃取技术（DLLME）、双水相萃取技术（ATPE）等。其中，分散液–液微萃取技术是一种新型萃取技术，基于液–液萃取的技术基础，萃取液用量小，通过在萃取体系中添加分散剂，增加萃取剂与目标物的接触面，使目标物在样品溶液和小体积萃取剂间的分配达到平衡而完成萃取［1–3］。

1.2 特点

液–液萃取可从干扰物中分离目标成分，达到除杂、净化、分离的目的，一般是将目标成分从水溶液中抽提至有机相中，含有目标成分的有机相经溶剂挥发容易富集浓缩，有利于被测物中低含量目标化合物的检测。液–液微萃取中萃取溶剂所用的挥发性溶剂用量一般在1 mL 以下，有的已被毒性低的离子液体萃取剂替代，减少了对操作人员的危害并提高了目标化合物的回收率［4–5］。

1.3 应用

马海峰［6］等向样品中加入体积分数为85%乙腈溶液进行提取，加入亚铁氰化钾和乙酸锌除去蛋白质，样品混匀后以5 000 r/min 离心10 min，吸取上清液加入正己烷除去杂质，再加入三氯甲烷进行萃取分离及浓缩。利用高效液相色谱仪对样品进行等度洗脱，以荧光检测器测定，分别选取花生等8 种不同基质进行加标回收试验，结果高浓度加标组回收率略高于低浓度加标组，回收率为75.9%～94.7%。

肖之敏［7］等采用分散液–液微萃取方式对凉茶中6 种有机磷进行提取、净化，降低了基质效应，实现了目标物的快速富集。实验比较了石墨化炭黑（GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、氨丙基粉（NH2）、N-丙基乙二胺（PSA）4 种净化剂对样品的净化效果，结果显示PSA 效果最佳但其用量对回收率有影响，研究确定最佳用量为1.5 g。选择甲醇为分散剂，用量仅100 μL，萃取剂选择200 μL的三氯甲烷。实验结果表明，乐果、敌敌畏等6 种有机磷校正曲线的线性相关系数均大于0.999 0，以0.25 μg/kg 为基准进行加标回收试验，分别添加1 倍、2 倍和10 倍的有机磷后，平均回收率为73.6%～99.5%。

作为一种新型的液–液萃取方式，分散液–液微萃取技术回收率和富集倍数高，萃取速度快，使用溶剂少，其研究方向在向毒性较低的新型萃取溶剂发展，如离子液体萃取溶剂，这些离子液体环境友好，溶解能力强，毒性低，提取效率高［8–11］。

2 固相萃取技术

2.1 原理

固相萃取（Solid phase extraction，SPE）是将柱色谱与液–固萃取相结合的一种样品处理技术，基于液相色谱分离的基本过程，固相萃取根据样品的溶剂及目标化合物的性质选择特定的吸附剂（正相、反相、离子交换等）作为固定相吸附化合物，再选择特定的洗脱溶剂去除样品中的非目标化合物，收集需要的目标化合物，以选择性吸附与洗脱的方式实现目标化合物的富集、分离与纯化［12］。

2.2 特点

自1970 年发明以来，固相萃取技术发展非常迅速。固相萃取所需的样品量少，耗费溶剂少，操作简单，能够高效实现目标成分的纯化，应用广泛，特别适用于那些基质复杂、目标成分含量低的样品处理，并且该处理方法的重现性较好［13］。

2.3 应用

固相萃取技术在食品、环境、医药等多个领域有着广泛的应用。

李珊等［14］使用固相萃取的方法对样品进行净化，建立了高效液相色谱法测定婴幼儿米粉中烟酸、烟酰胺的方法，有效缩短了样品处理时间，避免了长时间高温处理可能造成的目标成分转化问题；该方法的回收率为93.3%～102.5%，其稳定性、重复性良好，适用于各种婴幼儿米粉中烟酸与烟酰胺的测定。

安智慧等［15］采用氨基固相萃取柱对22 种蔬菜提取液进行净化，建立了高效液相色谱法相同时检测蔬菜中6 种农药残留的方法，该方法样品处理时间短，并降低了样品处理所需的试剂用量。

张鸣珊等［16］建立了检测环境水体中两种磺胺类药物的方法，对比并选择了最适宜的金属有机骨架材料分散固相吸附剂，该方法的加标回收率为71.2%～91.9%，具有简单、快捷且对环境友好的特点。

梁冬牛等［17］将索氏提取后的样品使用固相萃取柱净化，建立了超高效液相色谱法同时检测舒肝和胃丸中5 种成分的方法，该方法的加标回收率为92.83%～95.72%，方法稳定可靠。

基于固相萃取技术的特点，它在复杂基质样品中微量化合物检测中的应用将越来越广泛。而随着通用技术的不断发展，固相萃取技术也在不断革新，未来固相萃取技术将朝着易于操作与自动化的方向发展，以进一步降低实验人员的工作强度，节约时间，提高工作效率，同时通过仪器自动控制减小人为操作的误差［18–19］。目前市面上已有仪器厂商推出了多种不同类型的全自动固相萃取仪，在企业中得到了推广应用。

3 固相微萃取技术

3.1 原理

固相微萃取（Solid phase micro extraction，SPME）是以固相萃取为基础发展起来的一种萃取分离技术，它是利用涂覆或键合有吸附材料的石英纤维等来吸附、富集样品中目标成分的一种样品处理方法，原理是将萃取相暴露于待分析物的样品基质中，达到吸附平衡，结合吸附平衡理论计算被萃取的分析物的量［20–21］。

3.2 特点

固相微萃取继承了固相萃取的一些优点，又克服了它的一些不足，它将样品的采样、萃取、浓缩、分析进行了有效整合，简化了样品制备与分析过程。这种方法无需有机溶剂，简单方便，速度快，费用低，几乎克服了传统样品处理方法的所有缺点，能够与气相或液相色谱仪联用，特别是与气相色谱仪联用有很多应用［22］。

3.3 应用

固相微萃取技术在食品、药品、环境和生物样品等领域应用广泛。

马明广等［23］通过组装得到二氧化钛纳米管纤维，将其与高效液相色谱仪联用，建立了测定水样中多环芳烃的方法，通过优化确定萃取条件，该法线性范围宽，灵敏度高，选择性和重复性好，满足分析要求。

唐可仁等［24］采用溶胶–凝胶法制备了石墨烯中空纤维，并将其与高效液相色谱仪联用建立了一种测定牛奶中氟喹诺酮类抗生素残留的方法，该方法的检出限为0.38～0.70 μg/L，加标回收率为75.2%～95.4%。该法有效降低了基质效应，具有较高的灵敏度与准确度。

谈思维等［25］制备了葡萄糖包裹Fe3O4磁核的复合材料，并将其与高效液相色谱仪联用，建立了尿液中苯巯基尿酸含量检测的方法，该方法的检出限为0.003 mg/L，加标回收率为96.1%～104.7%，灵敏度较高，且有机试剂用量少。

固相微萃取为复杂基质样品的制备提供了一种新型方法，在一些领域得到了应用。未来需要进一步加强对涂层材料、微型化固相萃取模式等方面的研究，同时进一步加强与色谱技术联用的研究，不断拓宽其应用范围［26］。

4 微波萃取技术

4.1 原理

微波萃取（Microwave extraction，MAE）是一种近年被广泛推广的萃取技术。微波萃取技术采用高频电磁波穿透，使物料内部快速升温，从而利用高压破坏物料细胞，实现有效成分分解。同时，微波所产生的电磁场可以加快目标组分在萃取溶剂中的溶解，从而缩短萃取时间，提高萃取效率［27］。在使用微波萃取时，不同目标化合物主要对溶剂、温度、pH 值以及萃取时间进行优化和选择，萃取温度过高会破坏目标化合物，导致目标化合物损失，降低萃取率，同时萃取时间过长也会导致目标化合物的损失。

4.2 特点

微波萃取方法可根据物料中不同成分受热情况，采用程序升温模式，将有效成分提取处理。同时微波萃取时没有高温热源，可以更加有效的提取一些热敏感物质［28］。微波萃取可以利用电磁能促进物料升温分解，提取速度较传统的索氏提取更快，时间缩短至十几分之一；另外，微波萃取提取时可选择的溶剂较多，且均有良好的相溶性，操作更加便捷，从而达到节省成本、提高萃取效率的目的［29］。总体来讲，微波萃取技术比传统的有机溶剂萃取、索氏提取等方法更加高效、简便，不仅大幅降低实验成本，而且提取率较高，对提取物具有一定提纯作用［30］。

4.3 应用

微波萃取在多糖含量中的应用，如采用功率为600 W，萃取时间为6 min，用以提取姬松茸中多糖，不仅节省提取时间，还使提取率达到14.2%［31］。以功率360 W，加热180 s，提取香茹中多糖，不仅使香茹多糖原有结构发生改变，提高了提取率，还将提取时间缩短至原来的百分之一［32］。再如洛龙党参多糖微波萃取，较传统索氏萃取效率更高，提取率达14.8%［33］。微波萃取技术在重金属检测方面应用颇广，如土壤或环境中砷含量检测前的样品处理，水产品中不同形态的砷、汞萃取，使用微波辅助萃取蔓越莓花色苷等。

微波萃取作为一种新形萃取分离技术，其分离度较好，且使用的试剂、设备较少，从而可减少污染，降低成本，受到科研工作者广泛青睐，具有很好的推广前景。

5 超临界流体萃取技术

5.1 原理

超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）在20 世纪70 年代主要用于工业生产中有机化合物的萃取［34］，随后逐步应用于分析领域。当某种物质处在超出其本身临界温度和临界压力的环境时，将呈现出一种气、液两相混合均一的流体状态，这就是超临界流体，它同时具有气体的黏度小、渗透力强特性及液体的高密度、高溶解力特性，因此可以快速、有效地从样品基质中分离出待测组分。超临界流体萃取即是利用超临界流体接触待分离的物质，将其溶解，再利用温度和压力的改变来改变流体的溶解能力，从液体或固体中萃取出特定成分，实现目标物与萃取剂的分离。

5.2 特点

大多数超临界流体萃取剂具有相对惰性、低毒、纯净、无残留等特点，萃取温度和压力也在相对安全的范围内，因此超临界流体萃取技术具有高效、环保、节能、易控制等优点，并被美国环保局（EPA）选定为推荐的标准方法［34］。常用的超临界流体萃取剂有CO2、NO2、SO2、乙烯、乙烷、丙烯、水等，其中CO2无毒无害、无腐蚀性，常用于食品领域，而乙烯、乙烷等对人体有害溶剂多用于食品以外的其它领域［35］。超临界流体萃取多用于处理固体样品，尤其是烃类及非极性脂溶性化合物的萃取，但对于大分子和极性基团多的物质萃取相对困难，可以通过加入甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯等夹带剂来改变其溶解性［36］。早在1989 年，于恩平等［37］就研究了加入丙酮和乙醇夹带剂对超临界CO2萃取胡萝卜素及罗汉果糖苷的溶解性、收率和选择性的影响情况，这也是国内关于夹带剂最早的应用研究［38］。

5.3 应用

超临界流体萃取技术的应用包括：从动植物中提取动植物油脂（如从甲鱼油中提取不饱和脂肪酸DHA、EPA［39］），从啤酒花中提取啤酒花浸膏；可以使奶脂脱除胆固醇，咖啡豆脱除咖啡因，烟草脱除尼古丁以及食品脱臭、食品杀菌等。除此之外，该技术还用于中草药中油脂、萜类、挥发油、黄酮、皂苷等各类化学成分的提取［38］，以及用于检测食品中氨基甲酸酯和有机磷、有机氯等农药残留量并对农药残留进行回收［40］。

吕小刚等［41］用超临界CO2萃取烟叶中农残马来酰肼，用高效液相色谱法检测马来酰肼残留量。

李英等［42］建立超临界流体萃取（SFE）–HPLC分离测定虎杖中大黄酸、大黄素及大黄素甲醚含量的方法。

超临界流体萃取具有高效、环保、节能等优点，但是也有一些不足及待改进之处，如超临界流体萃取装置价格高昂，运行成本高；需配合其它技术（如超声波破碎、超声辅助、酶辅助等）共同使用来满足成分复杂中草药对产品纯度的要求；夹带剂的使用将复杂的高压相平衡更加复杂化，增加了成本，并增大了溶剂残留风险，需权衡利弊，选择使用。超临界流体萃取还可以与其它分析仪器如薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、凝胶渗透色谱（GPC）、四极矩质谱（MS）、傅立叶红外光谱（FT-IR）、电感耦合等离子发射光谱（ICP–OACS）等联合使用。研究人员在研究联用技术的同时，更侧重于提高超临界流体萃取与各种仪器联用时的检测限［43］。

6 加速溶剂萃取技术

6.1 原理

加速溶剂萃取（Accelerated solvent extraction，ASE）是近年来发展起来的一种萃取技术，通过提高温度（50～200 ℃）和增大压力（10.3～20.6 MPa），加大常规溶剂的萃取效率，减少溶剂的使用量。提高温度有助于提高待测物质在溶剂中的溶解度，减弱溶质和基质间的作用力，使溶剂更好地扩散在样品基体中；而增加压力可以避免液体溶剂在高温下气化，使溶剂仍保持液体状态，保证溶剂对溶质的溶解能力，从而提高溶剂的萃取能力［34］。

6.2 特点

与传统提取方法相比，加速溶剂萃取在提取速度、溶剂用量、自动化程度等方面有明显优势：萃取效率高，一般一次萃取全过程仅需12～20 min；有机溶剂用量小，10 g 样品仅需15～45 mL 溶剂；自动化方法，用户编程，全自动控制，可实现多次萃取或改变溶剂萃取等操作；操作便捷，安全性高；基体影响小，适用范围广，样品中水的质量分数在75%以下的固体、半固体均适用；方法发展方便，已成熟的溶剂萃取方法都可以转化成为加速溶剂萃取方法［44］。

6.3 应用

加速溶剂萃取技术应用广泛，可以用于环境样品中氯化物和有机磷、有机氯杀虫剂、多环芳烃、多氯联苯等有毒有害物质的提取，食物中的游离脂肪、食品添加剂残留物的提取［45］，植物源食品的农药残留分析［46］，中药成分的萃取剖析等。并且可以与QuEChERS［47］、固相萃取［48］、磁固相萃取［49］等样品处理技术联用，有利于增强净化效果，降低固体样品基质效应，提高方法灵敏度。

黄北熊等［50］对利用ASE–HPLC 提取、测定保和丸中橙皮苷含量的方法进行了研究，同时与传统的索氏提取法进行比较，结果显示采用ASE 技术萃取保和丸中的橙皮苷，不仅缩短了提取时间，提高了橙皮苷的萃取效率，而且减少了溶剂的消耗。

陈荣祥等［51］用加速溶剂萃取–超高效液相色谱法建立一种简单快速、有机溶剂用量少且适合大批量枇杷叶样品中齐墩果酸、熊果酸的检测方法，为该技术在中药质量控制中的应用提供了方法借鉴。

7 浊点萃取技术

7.1 原理

浊点萃取（Cloud point extraction，CPE）是在样品溶液中加入表面活性剂，产生增溶和浊点现象，再改变温度、压力、pH 值或电解质等参数，实现水溶性物质与亲油性物质分离的一种新型萃取技术。增溶指的是在水溶液中不溶或微溶的化合物能够结合到表面活性剂胶束（表面活性剂在水溶液中溶解达到临界胶束浓度时形成的胶束）上，增大溶解度；浊点现象指的是含有表面活性剂的水溶液在温度改变时出现的析出、分层现象，此时液体由透明变为浑浊，取其中的表面活性相溶解后即可进行仪器分析［52］。

7.2 特点

浊点萃取技具有安全低毒、操作简便、富集倍数高等特点：表面活性剂的毒性小、成本低，整个实验过程相对安全、经济；萃取过程简单、用时少，节省人力物力；在目标物从大体积的水溶液中分离、聚集到小体积的表面活性剂相中的过程中，同时实现富集和净化，可以实现痕量分析；浊点萃取技术还可以与液相色谱仪、气相色谱仪、分光光度计、荧光光度计等多种检测仪器联用［53］。

7.3 应用

浊点萃取技术可应用于环境样品、食品、生物制品、药品等多种样品的含量分析［52］。如血浆样品成分复杂、干扰物多，浊点萃取作为样品处理提取富集方法，具有试剂用量少、萃取率高和操作简便等优点，用于血浆样品处理，可简化样品处理过程，提高血浆样品检测的灵敏度［54］。在中药材成分分析与提取中，传统萃取方法耗时长，操作复杂，有机溶剂用量大，微量或痕量化合物萃取效果不佳，而浊点萃取方便快捷和富集分离良好，目前以TitonX–114、异构十三醇聚氧乙烯醚（GenapolX–080）和异辛烷等作为浊点萃取表面活性剂，从秦皮、杭白菊、白术和山茱萸等中药材中成功萃取得到芦丁、秦皮素、多酚类化合物及氰戊菊酯等多种物质［55］。

目前浊点萃取已经在原有的混合胶束介质萃取法、温度诱导浊点萃取法和凝聚萃取法三类方法中，发展出双浊点萃取法、顺序浊点萃取法、置换浊点萃取法、微波辅助浊点萃取法以及在线浊点萃取技术等［3］，将在食品安全分析、有机物的分离分析、金属离子分析、药品分析等多个领域等得到更好的应用。

8 总结与展望

随着技术的发展，液相色谱分析中的样品处理技术由传统的回流、超声、离心、过滤逐渐转变，有了新的动向：减少有机溶剂的使用，提高提取效率，样品微量化与复杂化、自动化，多种技术联合，在线联用等。新技术的发展和应用有助于提高样品处理的效率，降低测量误差，提高稳定性、安全性、便捷性，提升检测方法的适用范围和灵敏度，推动液相色谱分析技术的发展。