葛根芩连汤降低TNF-α 水平改善小鼠溃疡性结肠炎机制研究

李 静 王思晗 邹新丽 胡晨旻 虞燕萍 蒋春明

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因尚不明确的慢性、易复发的肠道炎症性疾病，是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）两种主要临床类型之一[1]。UC 好发于结肠远端靠近直肠的部位，病理表现为局限于黏膜及黏膜下层的连续性浅表性溃疡[1]。根据UC 的临床严重程度，治疗上常采用5-氨基水杨酸、皮质类固醇、硫嘌呤类药物和分子靶向药物等。由于药物疗程长、副作用大、价格昂贵，且病情容易反复进展，一定程度限制了临床应用[2]。当药物治疗无效或者发生急性重型UC 时，可采取手术治疗[3]。葛根芩连汤始载于《伤寒论·辨太阳病脉证并治》，以清热、坚阴、止痢为主，兼有透表、解表清里之功，临床上可治疗泄泻腹痛、感冒发热等。本研究采用自由饮用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）建立小鼠急性UC 模型，研究葛根芩连汤对其病理损伤和血清炎症因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 体质量20～24 g 的C57BL/6 小鼠34只，6～8 周龄，雄性，购自浙江中医药大学动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。小鼠在浙江中医药大学实验动物中心SPF 级动物房饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0012。环境温度（22±1）℃，保持12∶12 h 光-暗循环、自由进食饮水，适应性饲养1 周。本实验由浙江中医药大学动物伦理中心批准实施（伦理批准编号：IACUC-20201130-10）。

1.2 药品与试剂 DSS（美国MP Biomedicals 公司，相对分子质量36000～50000，批号S0798 和Q7418，货号160110）；柳氮磺吡啶肠溶片（上海信谊天平药业有限公司，批号09201121）；葛根芩连丸（广西壮族自治区花红药业股份有限公司，批号2020202）；小鼠IL-1β 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（南通飞宇生物科技有限公司，货号MM-0040M2）；小鼠TNF-α ELISA 试剂盒（南通飞宇生物科技有限公司，货号MM-0132M2）。

1.3 主要仪器 Thermo 905 系列超低温冰箱（上海百基生物科技有限公司）；RM2255 全自动轮转切片机（Leica Microsystems，Inc）；Beckman Allegra X-15R 高速台式冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）等。

2 实验方法

2.1 药物混悬液配制 参考临床治疗剂量，按人-小鼠等效剂量折算[4]，用蒸馏水配制柳氮磺吡啶混悬液260 mg/kg（相当于临床剂量成人2 g/70 kg）和葛根芩连汤混悬液390mg/kg（相当于临床剂量成人3g/70 kg）。

2.2 动物分组、造模与给药 小鼠适应性喂养1 周后采用随机数字表法分为四组：空白组8 只、模型组10 只、柳氮磺吡啶组8 只和葛根芩连汤组8 只，标记后称重。根据文献[2]采用DSS 自由饮用法诱导UC小鼠模型：除空白组外，其余各组小鼠予以2.5%DSS（分子量36000～50000）溶液代替饮用水供其饮用，隔3 d 更换1 次，连续6 d。在造模第5 天起柳氮磺吡啶组和葛根芩连汤组分别给予相应药物灌胃（给药容量为10 mL/kg），空白组和模型组灌胃等体积饮用水，每天1 次，持续6 d。

2.3 观察指标

2.3.1 小鼠一般情况观察 造模之日起，每天观察并记录食物的摄入量、小鼠体质量、粪便情况、精神状况等。参考文献进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分[5]：（1）粪便性状：正常成形便计0分，不黏附于肛门的糊状半成形大便计2 分，可黏附于肛门的稀水样便计4 分。（2）便血：肉眼无血便计0分，肉眼血便计4 分。（3）体质量减轻的百分比：0≤体质量下降＜1%计0 分；1%≤体质量下降＜5%计1分；5%≤体质量下降＜10%计2 分；10%≤体质量下降＜15%计3 分；体质量下降≥15%计4 分。DAI=（粪便性状+便血+体质量减轻的百分比）/3。

2.3.2 小鼠结肠长度测量、结肠组织病理学检测实验结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，钝性分离结肠组织，观察结肠形态并测量长度。将结肠组织放入10%的中性甲醛中固定24 h 以上，经过梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片（厚度4 μm），并附于高粘附载玻片上，烘干，次日进行苏木素-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察结肠组织形态学评估结肠病理损伤，进行组织学评分[5]：（1）炎症反应：无计0 分，轻度计1 分，中度计2 分，重度计3 分。（2）病变累及深度：无计0分，黏膜下层计1 分，肌层计2 分，浆膜层计3 分。（3）隐窝破坏：无计0 分，基底1/3 隐窝被破坏计1 分，基底2/3 隐窝被破坏计2 分，全部隐窝被破坏，但有完整上皮计3 分，全部隐窝及完整上皮被破坏计4 分。（4）病变范围：＜1%计0 分，1%～25%计1 分，26%～50%计2 分，51%～75%计3 分，76%～100%计4 分。

2.3.3 小鼠血清炎症因子IL-1β 和TNF-α 测定 摘眼球法取小鼠血液，常温静置30 min，于3000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃保存待测。使用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清IL-1β 及TNF-α 的含量，具体操作方法参照试剂盒说明书。

2.4 统计学方法 应用SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析。计量资料符合正态分布者以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐用LSD 检验进行两两比较，方差不齐用Tamhane's T2 检验进行两两比较。多组间存活率比较用卡方检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 不同组模型小鼠一般情况 空白组小鼠整体表现正常，体质量稳步增加，精神状态良好。其余各组小鼠在造模后第3 天起出现明显摄食减少、喜扎堆嗜睡，背毛蓬松粗糙且无光泽，体质量显著下降，并出现大便溏稀、血便。与空白组比较，模型组DAI 评分显著升高（P＜0.05）；经葛根芩连汤治疗后，葛根芩连汤组小鼠DAI 评分比治疗前明显下降，但与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。柳氮磺吡啶组小鼠在第7、10 天各死亡1 只，葛根芩连汤组小鼠在第8 天死亡1 只，各组存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠体质量、DAI 评分及存活率比较（）

表1 各组小鼠体质量、DAI 评分及存活率比较（）

注：空白组予生理盐水（10 mL/kg）灌胃；模型组自由饮用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液造模基础上予10 mL/kg 生理盐水灌胃；柳氮磺吡啶组自由饮用2.5%DSS 溶液造模基础上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩连汤组自由饮用2.5%DSS 溶液造模基础上予葛根芩连汤（390 mg/kg）灌胃；DAI 为疾病活动指数；“-”为无此项结果；与空白组比较，aP＜0.05

3.2 不同组模型小鼠结肠组织病理学改变

3.2.1 不同组模型小鼠结肠组织大体形态 空白组小鼠结肠黏膜表面光滑，无充血，无肿胀，无糜烂与溃疡；模型组结肠变短（P＜0.05），肠壁增厚，结肠黏膜充血水肿，伴有糜烂，肠腔内有不成形粪便；柳氮磺吡啶组、葛根芩连汤组小鼠结肠也可见不同程度的损伤，结肠长度和肠黏膜充血水肿情况有所改善，肠腔可见成形粪便，结肠长度与模型组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1 和表2。

图1 葛根芩连汤对UC 小鼠结肠长度影响

3.2.2 不同组模型小鼠结肠组织镜下观察 对各组小鼠结肠远端组织进行HE 染色，结果显示，空白组小鼠结肠上皮细胞完整，腺体排列整齐，未见炎症细胞浸润和溃疡形成；模型组上皮细胞损伤，腺体排列紊乱、破坏甚至消失，隐窝结构改变，炎症细胞浸润形成隐窝脓肿及溃疡，病变深度严重时可全累及浆膜层，组织学评分与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；柳氮磺吡啶组和葛根芩连汤组炎症细胞浸润深度及数量减少，上皮完整性、腺体排列改善，但组织学评分与模型组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2 和图2。

表2 各组小鼠结肠长度和组织学变化评分比较（）

表2 各组小鼠结肠长度和组织学变化评分比较（）

注：空白组予生理盐水（10 mL/kg）灌胃；模型组自由饮用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液造模基础上予10 mL/kg 生理盐水灌胃；柳氮磺吡啶组自由饮用2.5%DSS 溶液造模基础上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩连汤组自由饮用2.5%DSS 溶液造模基础上予葛根芩连汤（390 mg/kg）灌胃；与空白组比较，aP＜0.05

图2 葛根芩连汤对UC 小鼠组织病理学变化的影响（HE 染色，×200）

3.3 不同组模型小鼠血清炎症因子水平比较 与空白组比较，模型组小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，葛根芩连汤组小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平则明显下降，其中TNF-α水平差异具有统计学意义（P＜0.05）；与柳氮磺吡啶组比较，葛根芩连汤组小鼠血清TNF-α 下降明显（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平比较（pg/mL，）

表3 各组小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平比较（pg/mL，）

注：空白组予生理盐水（10 mL/kg）灌胃；模型组自由饮用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液造模基础上予10 mL/kg 生理盐水灌胃；柳氮磺吡啶组自由饮用2.5%DSS 溶液造模基础上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩连汤组自由饮用2.5%DSS 溶液造模基础上予葛根芩连汤（390 mg/kg）灌胃；IL-1β 为白介素-1β；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柳氮磺吡啶组比较，cP＜0.05

4 讨论

UC 作为一种复发-缓解交替的进行性发展的慢性结肠炎症性疾病，可累及肌肉骨骼、眼部和皮肤等多系统多脏器功能损害。目前UC 尚无根治办法，主要依靠抗炎药物来诱导缓解和维持治疗[3]。传统中医药根据“未病先防、既病防变、瘥后防复”的治疗原则，可在UC 病情发展不同阶段进行干预[6]。葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连和甘草四味中药配伍而成，作为经典古方，主要治疗太阳表邪内陷所致的热下利证。葛根芩连汤加减方或联合西药柳氮磺吡啶在临床上可作为UC 患者的一种治疗选择[7]，但由于中药复方组成的复杂性及作用机制的不确定性，一定程度限制该方的临床应用。新近研究发现，葛根芩连汤具有调节肠道菌群、修复受损肠黏膜以及维持肠道稳态等功能[8-11]。本研究结果显示，葛根芩连汤可以显著改善UC 小鼠结肠充血水肿，修复肠道组织损伤，促进溃疡愈合，证实葛根芩连汤对UC 动物模型具有一定疗效。

细胞因子具有调控肠道炎症，介导肠道免疫，维持肠道稳态的作用，在UC 的发病机制中发挥关键作用。TNF-α 和IL-1β 是急性UC 早期的重要促炎因子，可以通过招募并活化免疫细胞如T 细胞、先天淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILCs）等诱发肠道免疫反应，造成局部炎症[12]。TNF-α 通过与受体TNFR1和TNFR2 结合，发挥多种促炎功能，如使肠上皮细胞和潘氏细胞死亡，破坏肠道屏障；招募巨噬细胞浸润，从而分泌IL-1、IL-6 等促炎因子，抑制效应T 细胞凋亡发挥持续促炎作用等，从而参与UC 的发生发展[12]。同时，由CD14+巨噬细胞编码产生IL-1β，可与TNF-α、IL-6 和IL-23 共同诱导CD4+T 细胞分化为Th17，进而分泌更多TNF-α[1]。本研究结果显示，UC动物模型的血清TNF-α、IL-1β 表达水平显著升高，葛根芩连汤治疗可显著降低UC 动物模型血清TNF-α 表达水平（P＜0.05），而不影响IL-1β 表达水平，提示作为UC 早期肠道炎症指标的TNF-α 可能是葛根芩连汤发挥效应的分子靶点之一。在治疗糖尿病机制研究中发现，葛根芩连汤可抑制Toll 样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和磷脂酰肌醇三羟基激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）/雷帕霉素机械靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）信号通路来降低血清TNFα 的水平[9-10]，我们猜测葛根芩连汤在UC 模型中也存在相似通路来抑制TNF-α，需要进一步研究加以验证。既往文献报道，葛根芩连汤在迟发性腹泻模型中可显著降低IL-1β 水平[13]，而本实验结果显示葛根芩连汤不能显著降低UC 模型的IL-1β 表达水平，我们推测可能与研究所用的方剂组成、实验处置不同有关。

综上所述，葛根芩连汤具有改善UC 模型小鼠的临床表现及结肠病理学损害的作用，可能通过抑制TNF-α 的表达来发挥药理作用。葛根芩连汤含有葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸等多种中药活性成分[14]，它们对UC 免疫调节的机制、通路、靶点仍不清楚，因此今后将进一步深入研究揭示葛根芩连汤调节TNF-α 治疗UC 的潜在作用机制及鉴定可能的有效单体成分，为传统中医药临床治疗UC 提供实验依据。