祛瘀消肿方对LPS 刺激的巨噬细胞TLR4 信号通路调控机制的硏究

金 莉 潘怡宏

急性乳腺炎是女性产褥期常见疾病，常见于产后1～4 个月的哺乳期妇女，以初产妇多见[1]。目前广泛使用抗生素疗法，但存在菌株耐药、药物残留等弊端[2]。中医外治疗法在治疗急性乳腺炎方面具有广谱抗菌、抗炎、调节免疫等作用[3]。祛瘀消肿方为浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院院内协定方，方剂组成为生大黄粉30 g，芒硝120 g。自2012 年起在医院乳腺外科得到广泛应用，对于乳汁郁积和乳腺炎初期，临床疗效显著，能明显缓解乳房红肿热痛，但其具体作用机制尚不清楚。在炎症反应的初期，巨噬细胞作为效应细胞首先进入被感染区，随后激活并募集嗜中性粒细胞，组成机体抗感染的第一道防线[4]。本研究探讨祛瘀消肿方在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的乳腺炎过程中对巨噬细胞的影响以及祛瘀消肿方对炎症的抑制作用。

1 实验材料

1.1 细胞 RAW264.7 巨噬细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞库（美国模式培养物保藏所编号：TIB-71）。

1.2 动物 24 只健康成年SD 大鼠，体质量160～170 g，50 天龄，SPF 级，由杭州医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002；使用许可证号：SYXK（浙）2019-0011。在室温（20～25）℃，50%适宜湿度，12 h 光/暗循环下，自由获得食物和水。其中，18 只SD 大鼠用于制备祛瘀消肿方含药血清。本研究获动物伦理委员会审核备案（动物伦理批号：ZJCLA-IACUC-20020017）。

1.3 主要试剂 胎牛血清（美国Gibco Life Technologies 公司，批号10099-141）；噻 唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液（中国上海Beyotime公司，批号C0009M）；TransZol 试剂盒（北京全式金生物有限公司，批号ET101-01）；DNA 反转录试剂盒（日本Takara 公司，批号6110A）；荧光定量试剂盒（日本Takara 公司，批号639503）；实时荧光定量聚合酶链反应（quantitaive real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）相关引物（上海生工生物工程股份有限公司）；放射免疫沉淀试验（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）缓冲液（Thermo Fisher Scientific 公司，批号89901）；BCA 蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司，批号23225）；ECL 化学发光试剂（中国上海Beyotime 公司，批号P0018AM）；B 细胞淋巴瘤-2 蛋白（B cell lymphoma-2，Bcl2）抗体（批号3498S）、Bcl2 相关X蛋白（Bcl2 associated X，Bax）抗体（批号2772S）、Toll 样受体4 蛋白（Toll-like receptor 4，TLR4）抗体（批号14358S）、核因子kappaB 蛋白（nuclear factorkappaB p65，NF-κB-p65）抗体（批号8242S）、核因子κB 抑制剂α 蛋白（nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，IκB-α）抗体（批号4812S）和磷酸化IκB-α 蛋白（phosphorylation of IκB-α，p-IκB-α）抗体（批号2859S）（美国Cell Signaling Technology 公司）；磷酸化NF-κB-p65 蛋白（phosphorylation of NF-κBp65，p-NF-κB-p65）抗体（英国abcam 公司，批号ab76302）；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）（批号CSB-E04741m）、白细胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）（批 号CSBE08054m）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（批号CSB-E04639m）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）kit 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。

1.4 主要仪器 冷冻高速离心机（美国Thermo 公司，型号：Sorvall Legend Micro）；电泳仪（WIX 韦克斯，型号：EP600）；蛋白转移系统（WIX 韦克斯，型号：EP600）；多孔分光光度计（LabServ，型号：K3 TOUCH）；倒置荧光显微镜（Leica，型号：DMIL LED）；实时荧光定量PCR 仪（贝克曼，型号：ABI7500）；细胞培养箱[Heal Force，型号：HF90（HT）]。

2 实验方法

2.1 细胞培养 使用DEME 培养基，在37 ℃和5%CO2的培养箱中培养RAW264.7 巨噬细胞，需添加10%胎牛血清。细胞分组：空白对照组（不作LPS 处理+无含药血清），LPS 处理组（LPS 处理+无含药血清），低剂量大鼠含药血清组（LPS 处理+低剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清），中剂量大鼠含药血清组（LPS处理+中剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清），高剂量大鼠含药血清组（LPS 处理+高剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清）。

2.2 含药血清制备 按随机数字表法将24 只成年SD 大鼠分为四组，每组6 只：祛瘀消肿方高、中、低剂量组和对照组（不作任何处理）。祛瘀消肿方实验用药由项目负责人所在单位中药制剂室提供，按“人和动物体表面积折算等效剂量比率表”计算，祛瘀消肿方低、中、高剂量组分别含生药4.5、9.0、13.5 g/kg[5]。每日灌胃1 次，连续7 d，于末次灌胃后2 h 大鼠股动脉采血。轻轻混匀枸橼酸钠溶液（1 mL 枸橼酸钠抗9 mL 血液）与采出的血液，防止溶血。3000 r/min 离心5 min，取上清液，56 ℃水浴30 min。0.22 无菌滤器过滤除菌并分装，于－20 ℃保存备用。

2.3 MTT 将细胞按1×104个/mL 浓度接种到96 孔板内，按照不同的实验方案处理细胞。再向每个孔中添加MTT 溶液，4 h 后，去除上清液，每孔加入100 μL DMSO，然后使用多孔分光光度计扫描测量570 nm处的吸光度，计算细胞活性。

2.4 qRT-PCR 巨噬细胞培养于6 孔板内（1×106cells/孔），待细胞密度达到80%以上后更换含不同剂量大鼠含药血清的培养基继续培养12 h，并用LPS刺激10 h，收集细胞。采用TransZol 试剂盒提取细胞总RNA。为检测凋亡相关基因（Bax、Bcl2）和TLR4水平，使用DNA 反转录试剂盒反转录合成cDNA，接着使用荧光定量试剂盒进行扩增定量，反应体系和条件按照说明书提供的方案进行。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因。相对表达水平均通过2-△△CT计算，△CT=CT目的基因-CTGAPDH。相关引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 相关引物序列

2.5 Western blot 用RIPA 缓冲液冰上裂解细胞30 min，并使用BCA 蛋白质分析试剂盒测定凋亡相关蛋白（Bax、Bcl2）和TLR4 信号通路相关蛋白（TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、IκB-α 和p-IκB-α）浓度，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。上样20 蛋白质溶液，80 V 20 min，120 V 60 min，待Marker 完全分离后，再转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h 后，将PVDF 膜与一级抗体在4 ℃下孵育过夜，PBS 清洗3 次，然后在室温下与次级抗体孵育2 h。配制ECL 化学发光试剂，X 射线胶片检测器观察反应蛋白。一级抗体：Bax（Rabbit，1∶1000），Bcl2（Rabbit，1∶1000），TLR4（Rabbit，1∶1000），NF-κB-p65（Rabbit，1 ∶1000），p-NF-κB-p65（Rabbit，1 ∶1000），IκB-α（Rabbit，1∶1000），p-IκB-α（Rabbit，1∶1000）。

2.6 ELISA 将巨噬细胞按1×106cells/孔的比例接种于6 孔板内，待细胞密度达到80%以上后更换含不同剂量大鼠含药血清的培养基继续培养12 h，并用LPS 刺激10 h，收集细胞上清，用ELISA 技术检测炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）的水平，ELISA 具体操作步骤参照小鼠TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA kit 试剂盒说明书进行。

2.7 统计学方法 数据分析使用GraphPad Prism 7.0 软件。符合正态分布的测量数据以均数±标准差（）表示。采用双侧t 检验来比较两组数据中的个体差异，多组间比较采用单因素方差分析。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 祛瘀消肿方对LPS 刺激的RAW264.7 巨噬细胞活性的影响 先用不同剂量（低、中、高）祛瘀消肿方预处理RAW264.7 巨噬细胞12 h，再LPS 刺激10 h，采用MTT 法测定祛瘀消肿方对RAW264.7 巨噬细胞细胞活性的影响。结果显示，与LPS 处理组比较，随着血清中祛瘀消肿方浓度的增加，细胞活性增强（P＜0.05），并呈明显剂量效应关系，但细胞活性都低于空白对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 祛瘀消肿方对RAW264.7 细胞活性的影响（%，）

表2 祛瘀消肿方对RAW264.7 细胞活性的影响（%，）

注：空白对照组为RAW264.7 巨噬细胞不作LPS 处理，并添加无含药血清培养；LPS 处理组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加无含药血清培养；低剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加低剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；中剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加中剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；高剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS处理，并添加高剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；LPS 为脂多糖；与空白对照组比较，aP＜0.05；与LPS 处理组比较，bP＜0.05

3.2 祛瘀消肿方减少LPS 刺激的RAW264.7 巨噬细胞凋亡 先用不同剂量（低、中、高）祛瘀消肿方预处理RAW264.7 巨噬细胞12 h，再LPS 刺激10 h，采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核测定祛瘀消肿方对LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞凋亡的影响，结果显示，与LPS 处理组比较，细胞凋亡率均有一定程度的下降（P＜0.05），并且呈明显剂量效应关系，但细胞凋亡率都比空白对照组要高（P＜0.05），除高剂量大鼠含药血清组（见图1A）。qRT-PCR 和Western blot 结果表明，与LPS 处理组比较，不同剂量（低、中、高）祛瘀消肿方处理的RAW264.7 巨噬细胞抗凋亡蛋白Bcl2 的表达升高，同时，促凋亡蛋白Bax 表达降低。见图1B和表3。

表3 DAPI 染核活细胞数统计和Bax 与Bcl2 mRNA 表达水平比较（）

表3 DAPI 染核活细胞数统计和Bax 与Bcl2 mRNA 表达水平比较（）

注：空白对照组为RAW264.7 巨噬细胞不作LPS 处理，并添加无含药血清培养；LPS 处理组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加无含药血清培养；低剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加低剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；中剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加中剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；高剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加高剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；LPS 为脂多糖；Bax 为Bcl2 相关X 蛋白；Bcl2 为B 细胞淋巴瘤-2 蛋白；DAPI 为4'-6-二脒基-2-苯基吲哚；与空白对照组比较，aP＜0.05；与LPS 处理组比较，bP＜0.05

图1 祛瘀消肿方对LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞凋亡的影响

3.3 祛瘀消肿方对LPS 刺激的RAW264.7 巨噬细胞炎症细胞因子释放量的影响 先用不同剂量（低、中、高）祛瘀消肿方预处理RAW264.7 巨噬细胞12 h，再LPS 刺激10 h。LPS 诱导后，RAW264.7 巨噬细胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达显著增加（P＜0.05）。祛瘀消肿方能显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 表达（P＜0.05），抑制作用呈明显剂量效应关系。见表4。

表4 祛瘀消肿方对TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平的影响（pg/mL，）

表4 祛瘀消肿方对TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平的影响（pg/mL，）

注：空白对照组为RAW264.7 巨噬细胞不作LPS 处理，并添加无含药血清培养；LPS 处理组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加无含药血清培养；低剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加低剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；中剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加中剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；高剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加高剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；LPS 为脂多糖；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白细胞介素-1β；IL-6 为白细胞介素-6；与空白对照组比较，aP<0.05；与LPS 处理组比较，bP<0.05

3.4 祛瘀消肿方对LPS 刺激的RAW264.7 巨噬细胞TLR4 信号通路的影响 结果显示，在LPS 刺激巨噬细胞10 h 以后，TLR4 信号通路中相关分子TLR4、p-NF-κB-p65 及p-IκB-α 表达水平均显著升高（P＜0.05），添加祛瘀消肿方血清，能够抑制表达的增加（P＜0.05）；NF-κB-p65 和IκB-α 表达水平均显著下降（P＜0.05），添加祛瘀消肿方血清，能够使表达增加（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 祛瘀消肿方对TLR4 信号通路相关蛋白分子的影响

表5 祛瘀消肿方对TLR4 mRNA 相对表达的影响（）

表5 祛瘀消肿方对TLR4 mRNA 相对表达的影响（）

注：空白对照组为RAW264.7 巨噬细胞不作LPS 处理，并添加无含药血清培养；LPS 处理组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加无含药血清培养；低剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加低剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；中剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS 处理，并添加中剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；高剂量大鼠含药血清组为RAW264.7 巨噬细胞LPS处理，并添加高剂量祛瘀消肿方大鼠含药血清培养；LPS 为脂多糖；TLR4 为Toll 样受体4 蛋白；与空白对照组比较，aP<0.05；与LPS 处理组比较，bP<0.05

4 讨论

急性乳腺炎是一种乳腺化脓性疾病。炎症的初期，巨噬细胞作为效应细胞首先进入被感染区[6]。研究表明，祛瘀消肿方中的大黄具有抗感染作用，且抗菌谱较广[7]，可通过抑制环氧化酶的合成起到抗炎的作用[8]。芒硝外用有清火消肿功效，可用于乳痈及痔疮肿痛等。两者合用能起到清热解毒、抗炎消肿止痛的作用。本研究结果显示，祛瘀消肿方增强LPS 抑制的细胞活性，并呈明显剂量效应关系。同时，祛瘀消肿方能够减少LPS 诱导的巨噬细胞凋亡。提示祛瘀消肿方能够通过调控巨噬细胞活性和细胞凋亡进而影响炎症反应。

TNF-α、IL-1β 和IL-6 是目前公认的主要促炎因子，这些因子在生物损伤中发挥重要作用，通过增加分泌量及瀑布式释放各种炎症因子，进而产生炎症反应[9-10]。本研究发现，LPS 刺激RAW264.7 巨噬细胞后，TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达量显著增加，发生炎症反应。祛瘀消肿方处理后，促炎因子表达被显著抑制，且抑制作用呈明显剂量效应关系。

病原微生物刺激机体后，位于细胞膜表面的TLR 受体能够传递刺激信号，激活NF-κB[11-12]。NFκB 复合体被活化后，IκB 被磷酸化，从而释放出NFκB 异源二聚体，使其进入细胞核内，进而启动TNF-α、IL-1β 和IL-6 等多种炎症因子基因的转录[13-14]。在体内，NF-κB 主要调节炎症性损伤的发展、细胞再生能力和细胞凋亡等[15]。本研究进一步发现，LPS 刺激RAW264.7 后，TLR4、p-NF-κB-p65 及p-IκB-α 表达水平均显著升高，NF-κB-p65 和IκB-α表达水平均显著下降，添加祛瘀消肿方血清，使得蛋白表达趋于正常，提示祛瘀消肿方能够对LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞TLR4 信号通路产生影响。

综上所述，祛瘀消肿方能够增强LPS 影响的RAW264.7 巨噬细胞活性，减少细胞凋亡，并且通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路产生抗炎作用。